年2月19日，哈佛大学和Broad研究所的刘如谦(DavidR.Liu)团队与哈佛大学医医院的董民团队合作在Science在线发表了题为Phage-assistedevolutionofbotulinumneurotoxinproteaseswithreprogrammedspecificity的文章，报道了他们利用噬菌体辅助的持续演化系统对肉*素的蛋白酶做了定向进化，首次实现了彻底改变*素蛋白酶底物特异性，创造出新的*素突变体可以在神经细胞里特异性切割对神经再生起阻碍作用的重要药物靶点蛋白（磷酸酯酶与张力蛋白同源物，PTEN）。该项工作也首次建立了一套完整的蛋白酶定向进化方法，具有重大的科学和应用价值。
特异性的蛋白酶在细胞和人体机能中起到重要的调控作用。目前基于蛋白酶的药物开发和应用局限于每种蛋白酶天然的特异性。对蛋白酶的改造工作在过去往往只限于扩展可以切割的底物范围，而不能同时消除其对天然底物的活性。哈佛大学和Broad研究所的刘如谦团队多年来一直在探索用他们实验室开发的噬菌体辅助的持续演化系统（PACE）来定向进化蛋白酶。为突破对天然底物的活性限制，刘如谦团队改进了持续演化系统，不仅可以通过正向筛选使蛋白酶识别一个全新的底物，也设计了反向筛选来去除原本的底物特异性，从而可以创造出人造的全新的特异蛋白酶(图1)。哈佛大学医医院的董民团队多年从事肉*素领域的研究。两团队合作选择了有广泛应用的肉*素蛋白酶作为实验对象，在三种不同的肉*素蛋白酶上开展了一系列的定向演化工作。
肉*素是一类由革兰氏阳性菌肉*杆菌（ClostridiumBotulinum）所产生的蛋白质*素。它十分特异地靶向神经细胞，是自然界中已知的*性最高的*素。近30年来，肉*素已经被广泛用于治疗慢性偏头痛、颈部肌张力障碍、尿失禁、睑痉挛和医学美容除皱。该*素家族目前已知有七种亚型（BoNT/A到BoNT/G）。所有的肉*素都由一条重链和一条轻链构成。重链主要负责靶向神经细胞和递送轻链到细胞内部。轻链是一个金属蛋白酶，负责特异性切割神经元内负责囊泡与细胞膜融合的相关蛋白（SNARE蛋白），从而阻止神经递质从囊泡中释放。每一种亚型的肉*素都会特异地切割一种或几种SNARE蛋白，例如肉*素A、C和E切割SNAP-25，肉*素B、D、F和G切割VAMP1、2、3，肉*素C还可以切割Syntaxin1。近期董民团队也发现了新型的肉*素X。这种*素可以切割6种SNARE蛋白，VAMP1、2、3、4、5和Ykt6，迄今为止自然界中可以切割最多种SNARE蛋白的肉*素(Zhangetal.,)。
刘如谦团队发明的PACE系统的主体是一个生物反应器，称为Lagoon，其中有M13噬菌体和大肠杆菌作为噬菌体的宿主。M13噬菌体基因组中的gIII基因被需要进化的蛋白酶基因所取代，而gIII基因所编码的蛋白pIII是噬菌体能否被正确包装和具有感染力的关键蛋白。当M13噬菌体感染大肠杆菌后，它的单链闭环DNA基因组会被转入大肠杆菌并转化为双链闭环DNA，称为选择质粒（SP）。大肠杆菌自身还有辅助质粒（AP）和突变质粒（MP）。辅助质粒编码一个活性被T7溶解酶抑制的T7RNA聚合酶和一个T7启动子控制的gIII。T7RNA聚合酶和T7溶解酶之间由一段蛋白酶可以识别并切割的底物多肽连接。当选择质粒编码的蛋白酶可以切割T7RNA聚合酶和T7溶解酶之间的连接时，T7RNA聚合酶的活性得以释放，从而开始转录gIII，得到有侵染活性的噬菌体。反之则无法得到具有侵染活性的噬菌体。突变质粒则表达一些提高DNA复制时突变几率的蛋白，在噬菌体DNA复制时引入突变到蛋白酶的基因中。由于这个反应器不断地有新鲜的培养基和大肠杆菌宿主流入，并且有旧的培养基和大肠杆菌流出，只有当一个噬菌体编码的蛋白酶可以激活T7RNA聚合酶产生新的更多的具有感染力的噬菌体的时候，这个噬菌体才能通过不断地感染新的大肠杆菌并复制而留在这个反应器之中。由于噬菌体的生命循环时间很短约10分钟，所以每天可以进行大数量的筛选并且整个过程不需要很多的人工干预，极大地提高了分子进化速度。
为了可以降低进化的蛋白酶对原始识别序列的活性。刘如谦实验室在原先正向选择的系统上，在大肠杆菌宿主里添加了一个反向选择质粒(Morrisonetal.,)。反向选择质粒编码一个由蛋白酶原始的识别序列多肽连接的T3‘RNA聚合酶和T7溶菌酶，和一个由T3启动子控制的显性失活gIII。当噬菌体所编码的蛋白酶既可以激活正向选择质粒gIII的表达和反向选择质粒的显性失活gIII表达时，产生的新的噬菌体不具备感染性。也就是说，只有进化活性而没有原始活性的蛋白酶将会拥有选择优势而被筛选出来。当正向选择和反向选择同时进行时，他们之间的最佳相对选择强度一般很难预测，往往需要同时做几种选择强度的路线去寻找一个较好的条件。由噬菌体辅助的持续演化系统（PACE）简化而来的噬菌体辅助的非持续演化系统（PANCE）有利于实验者同时进行多条不同条件的进化，常被用于同时进行正向和反向选择。
图1：PACE模式图
首先，作者选择野生型的肉*素X的轻链作为目标，利用PANCE系统将肉*素X的偏好性向VAMP4和Ykt6进化。经过进化得到的突变体X()B1和X()B1分别对Ykt6和VAMP4的偏好性相对于VAMP1有了大幅提升。这两个肉*素X轻链突变体也可以在全*素的形式下被递送到体外培养的大鼠的神经元里切割其底物。
将一个肉*素的轻链进化为可以识别并切割新的SNARE蛋白底物是一个更具挑战的任务。VAMP7是一种非经典SNARE蛋白，在蛋白的转运，分泌和细胞自噬中发挥重要作用。已知肉*素都不能切割VAMP7。作者利用PACE的正向筛选逐渐将肉*素F轻链进化为对VAMP7具有切割活性，得到突变体F()B6。虽然F()B6可以切割VAMP7，但是它还对保留有VAMP2的切割活性。又经过一系列的反向筛选，作者得到了另一个突变体F()A3。这个突变体在体外酶活实验中展示了很高的VAMP7和极低的VAMP2切割活性(图2)。
图2：肉*素F的突变体F()A3的体外酶动力学曲线
第三个，也是本文中意义最为重大和最难的工作是将肉*素E轻链从切割SNAP-25进化为特异性地切割磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）。PTEN是一个磷酸酶，将PI3P转化为PI2P，负性调控细胞膜上的PI3P水平，从而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路并抑制细胞增殖。突变导致PTEN功能缺陷是一些细胞癌变的重要原因，因此PTEN也被认为是一种抑癌蛋白。不过在神经元再生方面，PTEN却起到了抑制再生的作用。在受损的中枢神经元中敲除PTEN已经被证明可以极大地提高神经元的再生能力。
作者通过生物信息学比对选择了PTEN表面一段没有固定构像的肽段作为潜在的酶切靶点。这一段序列的20个氨基酸中仅有4个与SNAP-25序列相同。经过一系列的正向和反向筛选作者最终得到了一个突变体E()A2。在体外酶活实验中，E()A2对PTEN有较高的切割活性，而对SNAP-25的活性极低。但是当将E()A2和PTEN共同表达在HEKT细胞中时，并没有观察到明显的PTEN切割。作者分析也许由于PTEN在细胞膜上行使功能，而E()A2主要在细胞质中，所以切割效率不如预期。当作者将定位在细胞膜上的PH结构域和E()A2融合表达时，全长PTEN的水平显著下降。作者还通过病*转染的方式在体外培养的大鼠皮质神经元中表达了PH-E()A2，发现相对于对照组神经元中的PTEN水平有明显的下降，并且在神经细胞内部只有极低的SNAP-25切割活性。在E()A2的基础上，作者根据肉*素E识别SNAP-25蛋白结构方面的知识又加入了一个突变LA，完全消除了对SNAP-25的切割活性。
图3：肉*素E的突变体E()A2对大鼠皮质神经元PTEN的降解
综上所述，本研究利用PACE平台实现了对肉*素的活性实现了重新设计，不仅可以使其识别一个全新的底物，还可以通过反向筛选几乎完全去除了原本的活性和神经*性。令人惊叹的是在PTEN和SNAP-25序列同源性极低的情况下也实现了进化，创造出了一个全新的蛋白酶。具有PTEN切割活性的PH-E()A2有巨大的潜力用于促进神经损伤后的再生。该技术也可以广泛应用于未来的蛋白酶和蛋白药物工程改造。
哈佛大学和Broad研究所的TravisBlum博士为本文第一作者，研究团队成员包括刘如谦实验室MichaelPacker博士和MichelleRichter，和董民实验室刘浩博士，熊小哲博士，Pyung-GangLee博士，和张四才博士。
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