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3.3其它HPLC检测器
UV检测器有时不适用，因为有关被测物没有UV吸收。更多的情况是被测物仅有很小的吸收值(E)，而流动相又不允许在短波长进行UV测定。此外被测物浓度较低，以至信噪比太低无法用UV检测。在放弃使用UV检测器之前，应采用式3.4确证UV检测确实不能使用。只有在使用UV检测器无希望的情况下，才可以考虑使用其它类型检测器。
3.3.1通用型检测器
UV检测器除了有些化合物的灵敏度太低外，还会因不同样品组分的E值相差巨大(-0倍)而可能对结果产生影响。在样品组分未知的情况下(无校正用标准品，至少开始时不知)，峰大小不能确切代表组分的相对浓度。如，制定规章的机构可能需找出产品原材料中含量超过0.1%W/W的所有杂质。然而，因为各峰E值的不确定性，不能用初始UV检测的色谱图识别出哪种组分的浓度超过0.1%。有些杂质的E值非常低，甚至可能检测不到，而其它低浓度的杂质则显示不成比例的大峰。
“通用型检测器”对几乎所有样品组分都有响应，包括那些UV灵敏度很低的组分。而且，检测器响应信号对不同样品组分的差异比UV检测器小得多。通用型检测器用途主要有两个
1）E值极低的样品;(2)用而积归一化方法，能为未知样品提供更有代表性的分析。当无被测物标准品作校正时，可近似地将面积百分比值看作/百分比值。通用型检测器还能使用在紫外区有强吸收的流动相。
该类检测器中最先使用且用途最广泛的是示差折光(RI)检测器。由于折射率是所有化合物的一个物理性质，(理论上)任一化合物至少可在中等浓度范围进行检测。因为流动相成分，包括溶剂和添加剂会显示明显的折光响应，因此不能使用RI检测器做梯度洗脱.另外，其它因素如需严格控制温度，流动相溶入气体的影响，痕量分析灵敏度不够等也限制了检测器的许多口常应用。
第二类通用型检测器为蒸发光散射(ELS)检测器。色谱柱流出物经过漂移管时，被喷雾和蒸发，被测物微粒在其通过光散射池时被检测。因此，ELS检测器的应用有被测物不挥发、和流动相挥发的限制。然而，因为ELS可用于梯度洗脱，在有些方法中，尤其是杂质分析中使用较多。
这两种检测器都对典型样品有类似的灵敏度，能够分析浓度在0.1μg/mL以上的组分(该检测灵敏度比UV检测发色团良好的化合物低约两个数量级)。表3-7总结了这两种检测器的一些特征。
3.3.2荧光检测器
基于被测物荧光(FL)的检测具有犀利的灵敏度与选择性，荧光检测器对痕量分析与复杂样品基质都很理想FL检测器的灵敏度一般比UV的高三个数量级。配有FL检测的HPLC分析可日常用于低至ng/mL级的定量分析，甚至可测定低至pg/mL级的样品浓度这些检测器的线性范围与UV检测器的相似(例如-)。
FL检测与UV检测的共同优点在于具有从干扰或背景峰中分辨出被测物的能力。由于具有天然荧光的样品很少，通常必须用带荧光团的试剂衍生化后，才可进行检测。羧酸、醇类、醛类、胺类、肽类、酮类、苯酚类和硫醇等可采用这种衍生化方法。
表3-7通用型检测器的特性
图3-2所示为典型FL检测器的结构示意图。由灯光穿过激发光滤光片，该滤片为激发样品分子提供所需波长的必不可少的单色光。激发光穿过流动池中的色谱柱流出液，使样品分子发出大于激发光波长的荧光（发射光)。第二只（发射光)滤光片与原激发光位置成90o处。这样只有样品产生的荧光能通过此滤光片，被送达光电倍增管，对发射信号进行定量。
普通检测器的设计有三种:滤光片–滤光片型(如图3-2)，光栅–滤光片型和光栅-光栅型，均与图3-2的原理类似。使用光栅可选择不同波长，而用滤光片则被限制在某一固定波长(除非更换滤光片)。光栅–光栅型荧光检测器可选择任意激发光或发射光波长;因此，对方法建立非常方便。另一方面，滤光片–滤光片型仪器简单、易用.价格低廉﹑选择性好，更适于不同的实验室之间HPLC方法的传递。因此，滤光片–滤光片型检测器更适于常规应用，除光栅与滤光片仪器的这些差别外，每种FL检测器之间的主要性能也有许多不同:包括流动池的设计和采集激发光的方式，激发光源的配置(氘灯、氙灯、氙-汞灯等)，单或双光束设计等。这些繁多的特性差别使不同型号的配检测器的性能(如灵敏度、线性)也有很大差异，以使建立的方法难以在不同仪器之间传递使用。
图3-2滤光片-滤光片型荧光检测器结构示意图
检测器设计的差异对实验室之间传递HPLC方法产生不利影响，使用FL检测器，尤其在方法建立中，由于FL信号和激发与发射的最佳波长与温度﹑溶剂的极性和粘度、pH等分离条件关系很大，因此最终的分离条件需在良好的分离与良好的检测之间做出妥协，也给HPLC-FL方法建立增添了更多困难。
3.3.3电化学检测器
常用于HPLC的电化学(EC)检测器按其操作可分为1)直流电流(DCA)或(2）电导率检测器。电导率检测器主要用于离子色谱，在此不作深入讨论。DCA检测器在灵敏度与选择性方面，很象FL。通常，FL检测器选择性更强，而DCA灵敏度则更高，具有EC活性的化合物比具荧光的化合物更为常见。荧光检测器往往在样品与荧光试剂衍生反应以后使用，EC检测一般不用衍生化。然而，有大量经系统研究的衍生化试剂和方法可用于将无EC活性的被测物转变成有活性的可检测化合物。这些方法包括柱前和柱后衍生化法，也可采用其它方法，如柱后固化酶处理法、柱后光解反应法和采用改善下游检测无EC活性被测物的双电极法(上游-下游;发生器-收集器)。
当UV的检测能力不能胜任所需选择性时，通常选择FL或EC检测器。如果被测物有EC活性，一般选DCA检测器较好，因为通常可不用样品衍生化并免去一些相关的问题。甚至有可能使用化学修饰电极，以检测无EC活性的被测物，如蛋白质和其他生物聚合物。
在各种LC-EC中，实际上被检测的是工作电极上产生的电流;这样，LC中的EC检测就是对电量的测定。通常，工作电极保持在一固定电位上，电极置于流动相的液流中时，由于流动相或污染物的氧化或还原，将产生背景电流。如果有EC被测物经过工作电极，则被工作电极氧化(或还原)，背景电流增加。EC检测的选择性经选择适宜的工作电极电势可进行调节，如只可检测到相关的被测物，而对其它杂质不响应。某些情况下，工作电极采用脉冲电势较好(三脉冲波形，脉冲电流检测，示差脉冲伏安检测等)，当氧化或还原的被测物可污染电极表面时，尤其如此。此时，只在规定的外加电压下测定电流.这种技术称为脉冲电流检测。
EC检测在氧化或还原方式中均可进行，主要取决于被测物的性质。氧化型EC检测比较常用，因为一般较易于(1)操作和试验常规样品，(2)保持工作电极表面的活性，和(3)免去某些常规还原型EC检测所需的制备步骤。还原EC法还会由于溶液中溶解氧的还原作用，降低信噪比。尽管有这些缺点，用双电极技术，尤其是如果将溶解氧仔细地从流动相和样品液中驱除，还原EC检测还能用。氧化与还原型EC检测的最终选择很大程度取决于被测物的类型(见表3-8)。
检测器对被测物的响应，受其分子结构和浓度以及检测池所加电压的控制。表3-8列出了一些适合DCA检测的化合物类型。在不同电压下重复样品的分离-检测(或流动注射分析-EC)可以优化DCA检浏所用的电势。
表3-8可采用电化学检测器进行检测的化合物类型
改善灵敏度和选择性(与UV检测相比)方面，DCA检测有很多优点，但也存在一些不起。除了样品必须具EC活性外DCA检测器的抗干扰能力也不强。工作电极易被污染，需经常清洗。检测器响应易受温度、流速(系脉动)和实验室的外来电信号影响。某些情况下，可能需特殊纯度的溶剂并需经常校正。此外，流动相必须满足离子强度和含水量等要求(随电极不同而异).这些要求限定了EC检测器一般不能用于大多数正相分离。不过，也有示例成功地说明用适宜的流动相添加剂(盐类)便能进行非水LC-EC。
EC检测液相色谱的最常见流动池设计为薄层池.将辅助电极直接置于工作电极的对面，有助于减少两电极之间的电压降。由于较高的被测物进样浓度不会使工作电极电势发生明显的变化，所以可达到较宽的线性动力学范围。在这种检测池中，流出液中仅有少许被测物参与EC反应，通常认为其为伏安检测器。
库仑EC检测器采用多孔石墨工作电极，使所有的流动相与被测物均与电极相接触。LC库仑电化学检测器的被测物转化率一般能达到%。直观地看，库仑检测器似乎比电流检测器的灵敏度高，由于转化的被测物更多，然而，决定灵敏度的是信噪比，多数情况下，电流检测器相对更灵敏。
大多数工作电极由玻璃化炭黑制成，这种材料对有机流动相的承受力强，Ag/AgCl参比电极和不锈钢辅助电极使用最多将两支工作电极并联或串联使用能增加其选择性。并联情况下，两电极直接对面置干流动的液流中，保持略微不同的电势(0.1-0.2V)。可将两工作电极上产生的电流比值与确证工作用的纯标准品进行比较，因为该比值对大多数化合物都是特异的。作为示例，表3-9所示为用在1.0-0.9V电压平衡的玻璃化炭黑工作电极与Ag/AgCl，对源于蛋白质胰蛋白酶水解液(cytC)的已知标准肽系列进行测定的(并联)双电极响应比值。
双工作电极技术类似于UV分析的双波长检测。通过比较色谱峰全部的双电极响应比值，有可能检验峰纯度。也有人介绍过在电流系统与库仑系统中，采用多通道的EC阵列检测，可以使一HPLC流出峰在极短的时间内得到大量的电势与电流数据。LC-EC中这种多电极的阵列检测器能提供与DAD类似的信息内容，区别仅在于用电化学，而非光学分光检测器进行化合物识别与纯度测定。许多化合物不与典型的工作电极材料如玻璃化炭黑发生EC反应。使得对化学修饰电极的研究十分活跃。经化学修饰的电极可以使原先不能转化的化合物发生氧化或还原，而且非电活性被测物与带电活性残基的衍生化反应也已取得成功。
表3-9肽的双电极响应比值
