生物分析专栏疫苗的研发及临床免疫原性分析 [复制链接]

来源：医药魔方

作者：阳光德美

　　从人痘及牛痘的发明直到现在，多年间，疫苗技术走过了漫长的发展道路。经历了以巴斯德发明的减毒活疫苗为代表的第一次疫苗革命，以重组核酸技术、蛋白质重组技术为基础的第二次疫苗革命，以及以核酸疫苗为核心的第三次疫苗革命。疫苗的发明和应用是现代医学最伟大的成就之一，是人类医学发展史上的里程碑，是人类控制传染病的主要手段，它在防治传染性疾病方面发挥着举足轻重的作用。为了更好地理解疫苗的作用机制和研发过程，本文将从免疫基本知识讲起，着重阐述疫苗的概念、作用过程、分类、发展历程，并对疫苗的研发过程，以及临床免疫原性分析方法学验证。

　　图1各种疫苗开发时间（来源于WHO）

　　一、免疫基本知识

　　1.1概念和分类

　　疫苗的发明得益于人类对免疫系统的认识和免疫学的广泛应用。免疫的传统概念是针对外来病原微生物产生的抗感染防御能力。现代免疫定义为对“自己”或“非己”的识别，并排除“非己”以保护体内环境稳定的一种生理反应。免疫系统在发挥正常的生理性反应时对机体是有利的，反之有害。例如，生理状态下，免疫系统通过清除病原微生物及其它抗原发挥其防御功能、通过清除损伤细胞或衰老细胞发挥免疫自稳功能，通过清除突变或畸变的恶性细胞发挥免疫监视功能；而病理状态下上述功能则分别表现为超敏反应或免疫缺陷病、自身免疫疾病、恶性肿瘤或持续性病毒感染。

　　免疫分为先天性免疫（innateimmunity，也称固有性免疫或非特异性免疫）和适应性免疫（也称获得性免疫或特异性免疫）。前者为通过遗传获得，反应迅速、针对范围广，由皮肤/粘膜屏障、血脑屏障、胎盘屏障等屏障结构，吞噬、分解生物大分子、消灭病原体的吞噬细胞，以及抗体、补体、溶菌酶等正常组织和体液中的杀菌物质组成。后者为个体出生后，接触抗原后获得，特异性强，具有多样性、记忆性、耐受性和自限性等特征，由B细胞介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫组成。先天性免疫通常只会减缓而不是阻断病毒感染，给适应性免疫反应创造时间。

　　图2先天性免疫和适应性免疫的特点[1]

　　1.2免疫应答

　　免疫应答是指免疫活性细胞识别抗原分子，自身活化（或失活化）、克隆扩增、分化及产生效应的全过程。根据免疫应答的细胞类型和效应分为T细胞介导的细胞免疫应答和B细胞介导的体液免疫应答及粘膜免疫应答。T细胞介导的免疫应答也称为细胞免疫应答。T细胞只能通过识别抗原呈递细胞（APC）呈递的MHC-I-抗原复合物，与其结合并分化为细胞毒性T细胞，最终针对侵入细胞内抗原及受感染靶细胞发挥特异性的杀伤效应。抗原呈递是特异性免疫的主要激活机制，体内重要的APC有树突状细胞（dendriticcells，DCs）、巨噬细胞、B细胞。引起细胞免疫反应的抗原主要是一些细胞内生存的活体抗原，如艾滋病病毒、结核杆菌、白色念珠菌等。

　　图3适应性免疫的类型[2]

　　体液免疫也称抗体介导的免疫，为机体成熟B细胞在特异性抗原刺激下，被激活、克隆扩增、分化为浆细胞，产生可与相应抗原发生特异性结合的抗体，同时分化为少数的记忆B细胞。根据产生机制通常可分为T细胞依赖途径和非T细胞依赖途径两种机制。T细胞依赖途径产生的免疫应答以强度高和持续时间长为特征，这种应答启动后，体内的记忆细胞会在机体再次遇到相同的抗原时产生免疫反应。蛋白类抗原和多糖、脂类等抗原大多通过T细胞依赖途径引起免疫应答。T细胞非依赖途径产生的抗体亲和力低、持续时间短、特异性差，且不如T细胞依赖的免疫应答作用强。多糖、脂类和核酸等抗原大多通过非T细胞依赖途径引起免疫应答。

　　抗体的产生在初次免疫应答和再次应答时表现出不同的特点。机体第一次接触某一抗原物质所发生的免疫应答即为初次免疫应答。当大量抗原初次进入机体时，APC为DC细胞、巨噬细胞，产生的抗体具有潜伏期长、滴度低、维持的时间短且多为亲和力较低的IgM类型等特点。机体第二次接触同样的抗原而发生的免疫应答为再次免疫应答。当少量抗原再次进入机体时，B细胞为主要的APC细胞，产生的抗体具有潜伏期短、滴度高、维持时间长且多为高亲和性IgG等其他类抗体等特点。当机体再次免疫应答在速度、强度及持续时间等方面不同于初次免疫应答的现象称为免疫记忆。

　　图4初次及再次免疫应答抗体产生的一般规律[3]

　　二、疫苗

　　2.1概念

　　疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的免疫制剂，免疫机体后可诱导产生特异性免疫应答而达到预防疾病的目的。疫苗保留了病原菌刺激机体免疫系统的特性。

　　2.2作用过程

　　接种疫苗后，免疫系统对其会进行的一系列应答反应，尤其在疾病的发展进程中，免疫系统的组成及其功能调控极其复杂。以肌肉注射灭活的流感疫苗为例，简述疫苗的作用过程。

　　经过肌肉注射作为抗原的流感疫苗，激活先天性免疫，同时APC对其进行处理。随后抗原或者携带抗原的APC通过淋巴液进入淋巴结，激活T细胞和B细胞介导的适应性免疫应答。若抗原为初次进入机体，那么免疫系统会针对该抗原产生具有记忆力的B细胞和T细胞，存在骨髓中。当该抗原再次侵入机体时，可激活骨髓中的记忆细胞，免疫系统对其产生再次免疫应答，从而达到疫苗的保护作用。

　　图5给予流感疫苗后产生的免疫应答[4]

　　2.3分类

　　世界上有超过20种不同疾病的人类疫苗，疫苗按照性质可分为传统疫苗和新型疫苗，传统疫苗包括：灭活疫苗、减毒疫苗；新型疫苗有亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗。除了本文提到的预防性疫苗，还有治疗性疫苗，如肿瘤疫苗、结核疫苗等。传统疫苗是通过传统技术制备而来，安全性高、有效性好，但是耗时长，新型疫苗耗时短，但是缺乏临床应用数据。不同类型疫苗的特点对比如下表1所示：

　　图6疫苗成功控制的疾病

　　图7部分类型疫苗示意图[5]

　　表1不同类型疫苗的特点对比

　　2.4发展历程

　　中国人最早采用人痘接种来预防天花，随后，18世纪英国采用牛痘接种预防天花取得了成功，牛痘代替了人痘，这为预防天花做出了巨大贡献。从此，疫苗经历了以灭活、减毒活疫苗为代表的第一次疫苗革命，以重组核酸、蛋白质重组技术为基础的第二次疫苗革命和以核酸疫苗为代表的第三次疫苗革命[6]。

　　第一次疫苗革命为19世纪末到20世纪初，“免疫之父”巴斯德认为微生物减毒或灭活后若能保持原有的某些特性。动物接种后可能轻微染病但不致死，可获得抵御这一微生物的能力。基于此观点，巴斯德建立制备减毒活疫苗的方法，利用高温培养获得了炭疽杆菌减毒株，并制成了炭疽疫苗。随后他又发明了鸡霍乱疫苗、狂犬疫苗。第二次疫苗革命从20世纪70年代开始，随着分子生物学、生物化学、免疫学等学科的发展，疫苗的研究已经从病原体、细菌体水平发展到分子水平，随之出现了基因重组疫苗，基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、基因缺失活疫苗、多肽疫苗，代表疫苗是乙肝疫苗（酵母和CHO）、流感疫苗、肝炎、脑膜炎和流感嗜血杆菌的多糖和多糖偶联疫苗等。第三次疫苗革命为20世纪90年代后，随着基因组学的发展，出现了以DNA、RNA为代表的核酸疫苗，代表疫苗为5价轮状病毒疫苗、流感活疫苗、新冠疫苗。

　　三、国内外获批疫苗现状

　　截止到年8月23日，FDA共批准疫苗89个，如表2所示。

　　表2FDA批准疫苗概况

　　注：数据来源于FDA
　　截止到年10月，NMPA共批准疫苗89种，如表3所示。

　　表3NMPA批准疫苗概况

　　注：数据来源于NMPA
　　四、疫苗的研发

　　疫苗不同于其它药品，主要表现在：它的作用机制是需维持较长的免疫反应、生产过程不同于生物制品、应用于健康人且通常是儿童[9]。与普通的化学药物不同表现在：疫苗是由不同性质和作用的物质共同组成的复合物，其基本成分包括抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他相关成分。这些基本要素从不同角度确保了疫苗能够有效刺激机体，产生针对病原微生物的特异性免疫反应，同时确保疫苗在制备和保存过程中的稳定性。疫苗是通过生物手段获得的生物制品，要将生长在细胞上，酵母或者细胞中的抗原释放、分离、纯化。种子和产量不可避免有较大的变异，需要较高的技术要求以及严格的质量把控，还需进行安全性、效力、纯度、无菌以及其它影响产品因素的相关实验，任何环节发生改变可能都会影响最终产品的稳定性和有效性。通常疫苗的研发经过探索研究阶段、临床前评价、临床研究到最终获批，历时约15-20年[9,17]。

　　4.1临床前阶段

　　疫苗的临床前阶段，是从概念验证到提交监管部门申请I期临床之前的研究。疫苗种类繁多，所以临床前研究涉及的产品特性、质量评价、安全性评价等研究也较为繁复。疫苗的临床前研究是评价候选物能从实验室走到临床的先决条件，需进行全面地研究，包括：进行动物水平的产品特征、概念验证/免疫原性研究、安全性等研究。需选择符合GMP的生产企业，GMP管理对保证药品的质量起到重要的作用。

　　4.1.1质量

　　国家对疫苗类制品需实施一级管理，质量管理包括疫苗批签发和监督检验，批签发包括批记录摘要资料审核和检验，批记录摘要资料审核要点为：关键工艺阶段生产和质量控制数据，菌株、原液、半成品和成品的检验结果。检验项目包括鉴别试验、外观、渗透压、pH值等理化项目；无菌试验、异常毒性和细菌内毒素检测等安全性项目以及效力试验ED50检测等；还应进行疫苗的结构、纯度、抗原性、免疫原性和稳定性评价[7]。采用的方法均需经过验证。由QP（qualifiedperson）确认产品的特性，出具疫苗的CoA文件，该疫苗产品即为被放行用于非临床和临床研究。CoA文件包含产品的特性、分析检测等，均符合企业SOP及法规要求。需针对疫苗生产者使用的原材料的质量控制建立产品放行标准（apanelofreleaseassays），包括鉴别、纯度、效力和稳定性。

　　4.1.2药理学和生物分布

　　药理学试验主要包括疫苗的作用机理、免疫原性和保护力、免疫程序和接种途径与效果的关系等。有效性需要通过动物实验建立有效的免疫原性记录范围，最好建立与保护性之间的相关性。应建立适当的试验方法评价疫苗的免疫原性或生物效价。如果有动物模型或可建立动物模型，可以采用动物模型直接评价疫苗的免疫原性。对一些有动物模型的感染性疾病，可以采用病原体的攻击试验评价该疫苗的保护效果。若无法建立动物模型，应建立能验证该疫苗有效性的体外试验进行评价。应考察接种的剂量与免疫原性的关系，通过试验优化免疫程序和接种途径，为临床试验方案提供参考。疫苗通常不需要进行药代动力学研究。必要时，应建立敏感的动物模型考察减毒活疫苗的生物分布，测定接种疫苗后的病毒血症（或菌血症）以及持续时间、排毒（菌）方式和途径，对是否呈现体内复制及器官组织的感染应进行研究[8]。

　　疫苗的传统给药途径是肌肉注射、皮下给药或者透皮给药，新型给药方式有粘膜（鼻腔、直肠或阴道）、口服或局部给药。当改变给药途径或者采用转基因动物等情况下，需进行药代动力学及分布研究。临床前应模拟临床给药方案，推荐R+1原则，即动物给药剂量组比临床拟给药剂量组多一个，而且给药时间间隔也较临床给药间隔短。可以通过在动物上观察的免疫反应动力学确定给药时间间隔。

　　4.1.3安全性评价[9]

　　动物水平的临床前安全性评价包括体外和体内研究，如表4所示。安全性评价包括疫苗产品各组分存在的潜在的内在外在毒性，如抗原、佐剂、赋形剂，以及在QC阶段未鉴定出的污染毒性。此外，疫苗的药效学作用可能也会促发免疫系统或者引起炎性反应而产生的毒副作用。毒性评价包括单剂量毒性试验、重复剂量毒性试验和安全药理试验；此外，当采用新的佐剂时需考察基因毒性；当疫苗考虑应用特殊人群，如孕妇或哺乳期妇女，应考虑考察生殖毒性。动物种属的选择较为困难，所选种属应该满足在接种疫苗后在人身上产生所预期的免疫反应的要求，并且对野生型病原体易感。若动物无法满足上述要求，可以考虑改变给药途径、给药体积以及获取免疫试剂。猴是用于疫苗安全性研究的最佳动物模型，但啮齿类动物和家兔较为常用。

　　安全性评价包括局部炎症反应、系统毒性和对免疫系统的作用。通常，采用一个种属进行重复剂量毒性研究进行评价，需检测动物状态，如体重、食物消耗量等。并需要收集血液和血清相关指标物质，用于评价疫苗引起的免疫反应。动物的尸体和组织需要进行组织学检查，尤其
　　表4Regulatorytoxicologyrequirement[9]

　　4.2临床研究

　　疫苗临床研究的目的是研究疫苗的安全性、免疫原性和有效性（保护效力）。通常疫苗的临床试验包括I期到III期以及获批后的IV期[18]。而对于如预防用生物制品3.3类“境内已上市疫苗”的狂犬病疫苗，通常开展I期和III期临床试验，其中I期临床以评价疫苗安全性为主，III期临床通常评价疫苗在目标人群中的有效性和安全性[19]。

　　4.2.1I期临床

　　I期临床目的是在少量人群中初步评价疫苗的安全性范围和免疫原性，通常采用20~80名受试者在多剂量水平下的安全性和耐受性，选择产生适宜的免疫反应的最低剂量进一步研究。通常选择在动物上已经评价过的2或3个剂量。试验设计通常采用盲法、安慰剂对照。全新疫苗尽量在I期临床取得一些免疫学（包括血清学）数据：免疫应答的水平和种类、抗体出现的时间及其滴度、抗体的持续时间、中和抗体的形成、抗体的交叉反应、对细胞免疫的诱导、可能影响免疫系统的相互作用（与已存在抗体的作用、与其他疫苗同时使用时的作用）等，为II期临床免疫接种方案（抗原剂量、接种次数、间隔时间）的设计及是否需加强免疫提供初步依据。免疫学参数应包括：抗体浓度范围、几何平均滴度（geometricmeantiters，GMT）、可信区间和免疫应答的持续时间（如抗体滴度的维持）等[10,11]。此外，即使疫苗是用于婴儿或者小孩儿，人体首剂量试验通常也是在成年人身上进行。

　　4.2.2II期临床

　　II期临床用于初步评价疫苗的安全性、评价免疫原性、确定免疫接种方案，通常要入组到名受试者。试验设计通常为随机、盲法、对照试验。免疫学数据应记录包括滴度的几何均数（GMT）、中位数、标准差（SD）和免疫前后血清抗体范围的数据。若疫苗判定终点是诱导抗体产生，应对免疫前、后抗体滴度或浓度达到规定（或已知保护性的）抗体水平的情况进行说明[12]。尚未建立免疫学保护力指标的疫苗主要观察指标应采用流行病学的保护率结果来确定疫苗的免疫效果，并建立分析免疫学替代指标（如血清几何抗体滴度或单位）与保护性的关系。已建立免疫学保护力指标的疫苗，采用国际上公认的与疫苗保护性相关的指标。一般可用体液免疫应答指标和细胞免疫应答指标，前者需测定特异性血清抗体滴度，统计各滴度的分布，计算血清抗体GMT[11]。IIa期
　　应仔细评价疫苗抗原的免疫应答，特别是与保护作用有关的特定免疫原诱导的免疫应答，如抗体水平、亚型、特异抗体功能以及抗体滴度出现和持续时间。也应记录其他相关信息，如中和抗体、交叉反应抗体、细胞免疫和可能影响免疫应答的其他因素（如已存在的抗体，同期使用的疫苗和药物）。如果疫苗保护作用的基本机制是细胞免疫，则在剂量探索试验中应建立合适的检测方法，以评价疫苗的保护作用。IIb期进行有效性概念性验证试验（proof-of-conceptefficacytrials，POC），需要的样本量从上百至上千，需要长期随访，试验设计为双盲、随机对照试验，有效性终点的选择至关重要，需建立“Go/No-Go”标准。

　　4.2.3III期临床

　　III期临床为大规模临床试验，明确疫苗的有效性和安全性。通常包含上千名受试者，当发现严重、罕见的不良反应时，需尽可能增大样本量，会达到上万人。核酸等特殊疫苗需要更长的观察和检测。Ⅲ期试验中应尽可能采取随机、对照、双盲和多中心设计。血清学数据至少来自根据预定的时间间隔采集血清样本，至少收集一个中心受试者的血清样本，以及所有确定为疫苗免疫失败的受试者的样本[12]。

　　4.2.4IV期上市后研究

　　IV期上市后研究用于进行罕见不良反应的评价，新疫苗在真实世界（reallife）的评价，以及免疫应答持续时间评价。免疫接种后的某些严重或罕见不良事件可能非常少，在II、III期临床试验中观察不到，因此在IV期临床试验期间还应进行监控。

　　图8疫苗的研发阶段[9]

　　五、临床免疫原性分析

　　免疫原性是疫苗从临床前疫苗候选物的免疫原性评价到临床研究及上市后研发的各个阶段及疫苗有效性评价时需要
　　免疫原性分析是生物技术药物和疫苗的临床研发中的重要部分。同样的分析技术应用于不同领域，侧重点和分析策略会截然不同。当评估生物技术药物的免疫原性时，主要
　　图9疫苗研发中涉及的不同类型的生物分析方法[14]

　　5.1细胞免疫功能评价

　　对于细胞免疫功能评价，一般建议检测抗原特异性T细胞反应及相关的细胞因子等。包括特异性T细胞：CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg细胞亚群；CD3+T细胞、CD20+B细胞和CD16+NK细胞的比例；以及T细胞免疫相关的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、TNF-α释放水平。

　　常用流式细胞仪来检测不同T细胞亚群。流式细胞仪既可以检测细胞表面marker，又可以对细胞内表达的细胞因子进行检测。

　　图10典型的T细胞分群流式细胞图[16]

　　5.2体液免疫功能评价

　　抗体分析方法的研究亦是疫苗研发的重要内容之一[17]。目前，现行有监管机构的指导原则和多个白皮书可以指导工业界建立血清学抗体分析方法，以评估体液免疫。疫苗临床试验中常用的抗体分析方法一般包括：标记免疫试验、中和试验、沉淀试验、凝集试验以及补体参与的试验等。免疫原性分析方法的选择应基于所检测抗体的类型及特点（结合抗体、中和抗体及抗体水平、亲和力等）、对应抗原物质的特点（颗粒性抗原、可溶性抗原等）和检测的目的（定性、半定量、定量）等确定。必要时，还需考虑自然感染和疫苗免疫抗体的差异[17]。

　　疫苗的临床样品体液免疫原性检测实验包括：方法建立（选择平台，建立分析批参数）、预验证（确认实验方法性能）和方法学验证（确认方法符合预设定的接受标准），见表5。通常，定性方法可能需要
　　表5疫苗血清检测方法确证和验证实验参数[14]

　　5.2.1方法建立

　　最初阶段建立方法的目标是选择合适的平台和适用的关键试剂，如标准参考物质和阳性对照。该阶段的困难是样品获取有限以及可能缺乏关键试剂。可以利用临床前阶段的血清（接种疫苗的实验动物）以及高滴度的血清样品初步摸索方法的参数。

　　方法需确保在多年内具有重现性，并且需要保证精确的滴度分析结果。应考虑使用国际标准参考物质（internationalstandard，必要时）。当无法获得时，可以选择高滴度的混合样品。标准参考物质可以采用任意的单位来定义（如四参数曲线的C-value），但重要的是要确保标准血清具有平行的稀释响应曲线。平行性的要求主要是为了确保样品浓度超过标准曲线的最宽范围时仍然可以确保检测结果的可靠性。

　　5.2.2方法确证

　　需预验证所有实验参数，可包括：精密度（Precision）、线性（Linearity）、范围（Analyticalrange）、特异性（Specificity）、准确度（Accuracy）、检测限（LOD）。此外，温度、孵育时间或缓冲特性（如pH值和盐浓度）以及实验天数、分析物和试剂批号的变化都可能影响检测结果，应在方法的早期研究阶段就
　　线性：疫苗的定量分析建议评估标准曲线的线性，依据平台的选择，线性评估包含不同方面，如：平行性、相对准确度、稀释线性。信号范围的线性与浓度线性范围是有差异的，前者为从一个进行稀释，类似于平行性，后者为从几个进行稀释。评价稀释线性，推荐采用剂量比例（doseproportionality）方法。对样品进行系列平行几份稀释。线性一般需要对标准品或已知含量的阳性质控品进行精确的系列稀释，在定量范围内采用空白基质制备至少5个稀释度（LLOQ，低浓度、中浓度、高浓度、ULOQ），由2名分析员至少2天，考察回算结果的变异。

　　范围：LLOQ和ULOQ定义为抗体的浓度范围，这个范围内，质控样品的准确度和精密度需符合要求，应可用于试验样品的定量分析。LLOQ可以用方法的相对准确度和精密度来评价。对于抗体结合实验，建议至少80％LLOQ以内的样品的变异小于20％。理想情况下，真实样品用于评价精密度和相对准确度，因为接种疫苗后，它们可反映多克隆免疫反应的变异。

　　特异性：方法的特异性是指方法能检测出待测物的能力，用于在特异性干扰物存在的情况下，方法检测待测物的准确度。特异性可以通过待测血清与同源或异源抗原预孵育进行考察。最终的采用5-10个样本添加一个浓度的干扰蛋白。样品的光强度（Opticaldensity，OD值）或者平均荧光强度（MeanFluorescentIntensity，MFI）信号应在线性范围内。抑制比例用于报告特异性结果。

　　检测限（灵敏度）：方法的检测限为方法能够检出的可区分出背景信号（LOB）的最低浓度。可通过加入2倍系列稀释的标准参考物质到空白或者阳性对照血清中（antibody-depletedhumanserum，ADHS）进行检测。方法检测限的评估可以单独进行，也可以作为精确度和准确度评估的一部分。

　　精密度（批内、批间和总变异）和准确度：批内变异（重复性）代表分析批内的变异，而批间变异代表不同天、不同人员、以及采用不同试剂运行的分析批之间的变异（中间精密度）。精密度的评价至少进行6次。准确度是指在一定范围内，检测值与理论值或参考值接近的程度。一般可以用回收率、相对偏差或其它适宜指标表示。一般通过对已知含量的阳性质控品进行测定，比较测定值和真实值之间的差异来进行准确度验证。

　　方法的耐用性：是指方法的可靠性，是条件发生微小变化时，检测结果不受影响的承受程度。方法的耐用性可通过测定条件的微小而故意的变化对方法的影响来进行评估。分析方法应具有良好的耐用性，验证时考虑的要素可包括样品采集、处理、存储及冻融的条件变化；检测所用试剂、设备仪器等的变化；反应的温度、pH值等条件的变化。根据具体情况，可针对一个或几个关键的条件进行验证。在每种试验条件下，均需对准确度、精密度或其他指标进行测定。

　　5.2.3方法验证[14]

　　如果方法已建立，确证也已高质量完成，方法学验证则相对容易开展。方法学验证需要验证方法的性能是否符合通过确证实验获得的预定接受标准。验证内容包括：精密度、线性、特异性、准确度、LOD，范围（LLOQ和ULOQ）。改变实验条件，如新的实验室、新的测试样品、受试者为新的年龄组别、特殊的疾病人群，需要部分验证或者全验证。短期稳定性评价样品的处理和储存对结果是否有影响。实验应模拟样品从采集到检测的过程，如冻融循环、短期2~8°C保存或者室温保存。一般来说，血清或血浆中的抗体在-20°C和-80°C条件下可稳定保存超过3~4年。基于此，无需进行样品的长期冻存稳定性考察。理想情况下，稳定性考察样品的浓度需覆盖实验的定量范围。如果临床样本的体积不足，可采用空白基质加标或者混合阳性样品。此外，如抗原包被的板子或者磁珠等关键试剂、样品预稀释等影响实验稳定性的参数也应进行考察。由于疫苗的生命周期可能跨度多年，所以方法的性能需保证稳定。长期实验质控的设置显得尤为重要。理想情况下，采用足够数量涵盖定量范围浓度的实际样品最为理想。关键试剂的更换需进行头对头比对，至少需要QC样品评价新批号关键试剂的质量，推荐采用实际样品进行关键试剂更换的评价。有时，关键试剂无法获得时，如过期，可以采用与历史数据进行对比的方式进行考察。

　　5.2.4实例

　　应用已经验证的分析方法，可以对受试人群接种疫苗后的免疫反应进行检测。通过抗体检测可以分析转阳率及抗体滴度几何平均数。一般而言抗体转阳率越高，抗体转阳时间越短，抗体滴度越高，疫苗起作用的时间越快。通过监测抗体的长期水平可以反应疫苗的保护作用的持久性。

　　表6接种不同HPV疫苗后抗体产生情况[21]

　　六、结语

　　控制传染性疾病最主要的手段是预防，而接种疫苗被认为是最行之有效的措施。疫苗发展到今天，已经能预防绝大多数的传染病，但随着时代的发展，疫苗的研究面临着更加艰巨的任务，如病原体的变异、抗原的提呈方式的改变以及内源性疾病疫苗的研制等。同时，传染病呈现回潮和增多的趋势，很多病种（如艾滋病）仍缺少有效的疫苗，新型疫苗仍存在安全性问题，这些都给疫苗研究带来新的挑战。随着科学技术的不断发展与研究人员的不懈探索，这些问题终将得以解决，并为人类健康服务。

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