北京的医院治疗白癜风 http://www.baidianfeng111.org/m/作为生物学研究领域的必备实验技能
#人生的高光时刻#WesternBlot（蛋白质印迹法）
在线折磨着一代又一代科研小白
从组织研磨到样品制备、蛋白定量
每个经验丰富的实验老手
以上步骤中的坑
几乎都要踩上一遍
“科研生涯走过最长的路，就是WB实验的弯路...”
每个生物专业的科研党
都有着一本厚厚的WB血泪史
一个个二十出头的小青年
被这位「中年大叔」整天按在地上摩擦
虽然是一个基础实验
但却是自然科学领域罕见的“玄学”操作
实验时间长、操作细节多
有时就算凑齐天时地利人和
也不一定能得到一组完美的条带
实验本身已经够难了
但是总是牵涉进
“造假”、“撤稿”、“学术不端”等丑闻
使得主流期刊对文章中WB数据的要求越来越高
众多杂志都要求作者提供相关的原始数据
甚至要求作者提供未切割的WB全膜条带
尽管WB实验这么玄
但有的坑还是可以规避的
今天就跟大家分享下
WB实验中你一定要避开的“坑”
如何拿到漂亮的WB结果！
重点来了
重点来了
VE-转移电泳槽是用来对少量核酸及蛋白质样品进行转移电泳的装置
操作简便，方便环保
创新设计，同时可以转印四块凝胶
做到一槽多用，可节省实验空间和经费
性能特点
槽体采用高强度和高透明度的聚碳酸酯材料注塑成型，免除液体渗漏的困扰。
多重安全设计，免除了可能产生的操作安全问题。
安全按钮式的开盖设计，方便电泳槽盖的开启。
专用开启式转移胶架，操作方便。
可同时转印四块9×9cm凝胶
专用蓝冰盒可反复使用，方便环保。
转印时间为15-60min，也可选择低电压过夜。
可以与VE-微型垂直电泳槽配套使用
流行外型设计，精品理念，超越国外同类产品同样水平。
具体课程介绍详见后文或戳图片链接
#后续会有更多干货哦#
蛋白质的提取
提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。
蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。
蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。
提高跑胶质量的Tips
小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。
胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。
内参的选择
做全细胞和细胞质的WB实验时，选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时，由于HistoneH3是染色体的组成型表达组分，表达相当稳定，并且特别好跑，可以算是细胞核内参的首选。
针对一些特定的内参，蛋白上样量超过一定的量时，出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin，当上样量超过20μg时，条带灰度不会呈线性的增加。因此，在做WB校正时，调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。
电泳中常见现象的处理
条带呈笑脸状：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高，而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形，所以因为赶时间而加大电压可能会出现这个)。应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。
条带呈皱眉状：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
条带拖尾：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
纵向条纹（纹理条带）：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。
条带两边扩散：加样量过多，弥散至孔周围了，减少上样量或者使用5X上样缓冲液。
WB结果中背景较高
膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液
一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度，或者是一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。
膜的选择有问题：选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点，膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。
检测时曝光时间过长，可减少曝光时间
WB结果信号弱或无信号
你所检测的样本中有不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，检测样本低表达目的蛋白，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。抑制剂）。
一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜，或者是由于二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。
洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
