北京白癜风的价格是多少 https://wapjbk.39.net/yiyuanzaixian/bjzkbdfyy/xcxbdf/草乌甲素(bulleyaconitineA,BLA)是从滇西民间用于镇痛抗炎的草药滇西嘟拉(Aconitumlongtounen-teT.L.Ming)中提取岀的生物碱巾，在临床主治风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、颈肩痛、腰腿痛、四肢闭合性骨折、癌症晚期镇痛及其他无菌性炎症疼痛。目前其作用机制的研究报道仅限于抗炎镇痛方面卩7,而草乌甲素对于免疫功能的影响未见报道。本组已观察到草乌甲素透皮贴剂对大鼠佐剂性关节炎有一定的治疗作用，因此本实验进一步观察草乌甲素整体给药对Balb/c小鼠免茂功能的影响。
材料和方法
材料与仪器草乌甲素(纯度＞98%,立方单晶)，由复旦大学药学院药剂教研室提供，批号o氢化可的松(hydrocortisone)注射液(中国信谊药厂；每支20mL：mg,批号)。小牛血清由上海实生细胞生物技术有限公司提供。细胞培养基rosewellparkmemorialinstitute(RPMI)-由GIBCO公司出品，批号65K。伴刀豆球蛋白(ConcanavalinA,ConA)批号L-、内毒素(lipopolysaccharide,LPS)批号C-,均由SIGMA公司出品。硝酸还原酶比色法测定试剂盒由南京聚力生物工程公司提供，批号。羊抗小鼠IgG和辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)由华美生物工程公司提供。酶标仪(型号WellscanMK3,芬兰雷勃公司)，低温高速离心机(型号：MR22i,Jouan公司)。
动物Balb/c小鼠，6周龄，体重(18.0±2.0)g,雌雄各半。上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，许可证SCXK(沪)-
药物配制草乌甲素碾磨成粉，溶于灭菌生理盐水(NS,2mol-L-1盐酸调节pH=5),配制浓度分别为0.04、0.08、0.16g-L-o
给药方案Balb/c小鼠随机分组给药，草乌甲素组分为0.08、0.16、0.32mg-kg-3个剂量组，阳性对照组为氢化可的松10mg-kg-1,空白对照组给予生理盐水(pH=5)。小鼠隔日称重，肌内注射2mLkg=给药d0~d6。d3每只小鼠腹腔注射5%疏乙醇酸钠1mL。d6尾静脉取血约50pL,用于测定总IgG。d7处死小鼠，取胸腺和脾脏称重，以每10g小鼠的脾重(mg)和胸腺重(mg)作为脾指数和胸腺指数，观察药物对各组的影响。淋巴细胞转化功能的测定讯71小鼠按上述给药方案，给药d7脱颈椎处死小鼠，无菌操作取脾脏，制备单个细胞的悬液。尼龙网过滤后计数细胞，将细胞悬浮于含10%小牛血清（FCS）的RPMI-中，按每孔1x个加入96孔U板，培养孔中或不加致裂原，或加入ConA（终浓度5mg-f）,或加入LPS（终浓度10mg-L-1）,37X.培养44h,加MTT（终浓度2g-L"1）,继续培养4h,xg,离心10min,小心弃上清，每孔加入二甲亚帆（DMSO）
iL,待结晶溶解后于nm酶标仪比色，结果以刺激指数显示（SI）。SI=D加人孜毂原/D
中性红比色法测定巨噬细胞（Me）吞噬能力闾
小鼠按上述给药方案，给药7d。小鼠处死前4d,每只腹腔注射5%疏乙醇酸钠1mL,d7脱颈椎处死。无菌操作取腹腔巨噬细胞。巨噬细胞数悬浮于RPMI-中，加入24孔板，每孔1mL（细胞数为2xlO^-L-1）,37您，5%CO2培养箱中贴壁2h。RPMI-清洗3次；每孔加入1mL含10%FCS的培养基，培养基内含LPS（终浓度lOmg-L-1）,于37°C,5%C02培养箱中培养24h；NS洗板3次，每孔加0.1%（kg-L-1）中性红1mL,37°C,5%CO?孵育20min,NS冲尽余液，每孔加细胞溶解液1mL（乙酸：无水乙醇=1：1,V：V，临用前配制），放置过夜，nm测定吸光度（D）。
巨噬细胞上清NO含量的测定间同上法培养腹腔巨噬细胞24h,取培养上清测定巨噬细胞上清NO含量。采用硝酸还原酶比色法，按试剂盒说明书操作，nm测定（D）。
血清总IgG的测定冈96孔酶标板（COSTAR）,以每孔
1L加入羊抗小鼠IgG5mg-L-1包被，加待测血清1:稀释，羊抗小鼠IgG-HRP按1：稀释，其余步骤按ELISA常规方法，nm测定D值。以标准含量的小鼠IgG制备标准曲线，计算小鼠血清总IgG量。
统计学方法用Statview软件，ANOVA分析,FishersPLSDtest分析数据组间差异。
结果
草乌甲素对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响在致裂原诱导的淋巴细胞转化实验中，与空白对照组相比，草乌甲素（0.32mgkgT）和氢化可的松均明显抑制ConA刺激的T淋巴细胞转化和LPS刺激的B淋巴细胞转化（P0.01）,两者作用无明显差别（P0.05）。草乌甲素0.16和0.08mg-kg-1对淋巴细胞增殖无明显抑制作用（P0.05）。见表1。
表1草乌甲素对Balb/c小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响
经ANOVA检验：与空白对照组比较，屮0.05,叩0.01；与草乌甲素0.32mg-kg-组比较：屮0.05,0.01；与氢化可
的松10mg-kg-1组比较：屮0.05,0.01
草乌甲素对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响用中性红比色法可测定M①吞噬能力，与空白对照组相比，草乌甲素0.08、0.16、0.32mg-kg1明显抑制M①吞噬能力（P0.05,P0.01）,但抑制作用均不及氢化可的松（P0.01）。与空白对照组相比，草乌甲素（d32mgkgT）和氢化可的松均明显抑制巨噬细胞培养上清中NO的含量（P0.05）,两者作用无明显差别（P0.05）；而草乌甲素0.08和0.16mg-kg1对培养上清中NO的含量均无明显降低作用。见表2。
表2草乌甲素对Balb/c小鼠巨噬细胞（m0）吞噬功能及其培养上清中NO水平的影响n=6,x±s
经ANOVA检验：与卒白对照组比较，护0.05,叨0.05.rP0.01；与草乌甲素0.32mg-kg-组比较：*P0.05,"P0.05；与氢化可的松10mg-kg-1组比较：田0.05,P0.05,P0.01草乌甲素对血清总IgG水平的影响在d6从小鼠尾静脉取血，测定血清总IgG水平。与空白对照组相比，草乌甲素0.16mg-kg-1和0.32mg-kg-1明显降低小鼠血清总IgG水平（P0.05,P0.01）o与氢化可的松和草乌甲素0.16mgkg"相比草乌甲素0.32mg-kg1降低抗体水平更明显（P0.05）。见表3。
草乌甲素对免疫器官的影响与空白对照组相比，草乌甲素和氢化可的松给药组小鼠脾脏指数有下降趋势，但无明显的统计学差异；与空白对照组
表3草乌甲素对Balb/c小鼠血清总IgG水平和脾、胸腺
指数的影响n=6,孑土s
经ANOVA检验：与空白对照组比较，"P0.05,bP0.05,
0.01；与草乌甲素0.32mg-kg-组比较："P0.05,-p0.05,P0.01；与氢化可的松10mg-kg-1组比较：护0.05,*P0.05
相比，草乌甲素0.16、0.32mg-kg-1和氢化可的松组的胸腺指数均明显降低(P0.05,P0.01)o其中草乌甲素0.32mg-kg-1组的胸腺指数明显低于0.08mg-kg-1组，且有统计学差异(P0.05)。见表3。
讨论
目前，临床应用的草乌甲素制剂有片剂、胶囊和注射剂03】。临床前药理研究和临床验证认为草乌甲素可能通过抑制前列腺素(PGE)的释放而对风湿、类风湿等疾病的症状有较好的改善作用曲51。在对草乌甲素的脂质体、透皮贴剂的药效学研究中，本实验室发现它有良好的抗大鼠关节炎症的作用。由于特异性和非特异性免疫应答均参与关节炎症的形成，我们采用草乌甲素整体给药，观察它对小鼠免疫功能的影响。
本次实验观察到草乌甲素对动物免疫器官有一定的影响，给药后小鼠脾指数有降低的趋势，胸腺指数则明显受到抑制。草乌甲素能明显抑制致裂原诱导的T、B淋巴细胞转化，降低小鼠血清总IgG水平。
巨噬细胞在炎症反应过程起着十分重要的作用。在局部或全身炎症反应过程中，巨噬细胞的活化会产生许多炎症介质，其中包括NO。许多全身炎症反应过程中可以出现严重的微循环障碍，TSAI等㈣阐述了一氧化氮合酶在炎症反应中可以诱导NO的大量产生和释放，NO在微循环障碍的发生和发展过程中起着重要作用；同时作为一种新的免疫分子和炎症介质，NO—定程度上介导了内毒素、TNF、IL-1、IL-6等细胞因子的病理作用M。本次实验显示草乌甲素对巨噬细胞的吞噬功能和分泌NO能力均有明显的抑制作用。
特异性T淋巴细胞的形成、B淋巴细胞的高度活化可使体内抗自身抗体水平升高并造成局部免疫复合物的沉积，联合局部巨噬细胞活化产生的大量的炎性分子和消化酶，共同参与了关节的持续炎症和病理损伤的形成问。草乌甲素对以上参与关节形成炎症的免疫细胞或某些分子的影响可能与其临床抗炎作用具有密切的关系。本次研究结果为草乌甲素临床应用提供了实验依据
