大家好，本周我给大家分享一篇Angewandte上的文章，"NucleobaseModifiersIdentifyTETEnzymesasBifunctionalDNADioxygenasesCapableofDirectN-Demethylation",本文的通讯作者来自宾夕法尼亚大学生物化学与生物物理系的RahulM.Kohli教授，该课题组的研究方向为胞嘧啶碱基的酶促脱氨，氧化和甲基化，重点是AID/APOBECDNA脱氨酶和TET加氧酶。5-甲基胞嘧啶（5mC）是一种表观遗传DNA修饰，在哺乳动物基因沉默，衰老和致癌过程中起着至关重要的作用。5mC到未修饰的胞嘧啶的转化主要由TET家族双加氧酶引发，而5mC的氧化标记为去甲基化的基础，但并未直接去甲基化。这个途径涉及TET介导的5mC氧化，生成主要产物5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），以及5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），最后将5fC和5caC切除，作为碱基切除修复途径的一部分，从而完成间接的脱甲基的过程。TET酶对5mC的间接脱甲基作用与Fe（II）/α-酮戊二酸（aKG）相关，这与双加氧酶家族中密切相关的家族成员形成鲜明对比。之前研究通过使用结构指导的生物化学和MD模拟的工作都表明人TET2的Asn在识别5mC的N4氨基上具有作用。具体来说，通过NA突变引起的Asn改变导致DNA中5mC的活性丧失。而鉴于蛋白质上的突变可能会影响结构域中的不同氨基酸中分子间的作用力，作者考虑对核碱基修饰的方式来探究5mC的活性丧失的原因。而本文采用的核碱基修饰方法，旨在对5mC底物进行有针对性的改变。作者首先使用固相合成来生成匹配的荧光素标记的27merDNA底物，该底物包含中央CXGG序列，其中X为5mC（F27-5mC）或5-甲基zebularine（F27-5mZ），这是一个缺少环外NH2的核碱基，该碱基将去除AsnH键的相互作用。作者首先检测F27-5mC和F27-5mZ对其底物消耗效率的影响。作者使用的是两种酶的偶联追踪TET介导的氧化。已知MspI酶可以切割5mC中的CXGG序列，但这种切割可通过将5mC氧化为5hmC或者甚至氧化到5caC而影响，然后作者巧妙地运用用T4噬菌体衍生的b-葡萄糖基转移酶（bGT）进行糖基化来阻止其进一步的反应。同时作者也发现了F27-5mZ也可以被MspI裂解。作者发现，在与TET2反应后，MspI对F27-5mZ的切割减少了，这意味着TET2能够催化F27-5mZ形成F27-5hmZ，并且通过bGT进一步减少了MspI对F27-5mZ的切割。该结果表明，在TET2的Asn与5mC外环胺之间不存在H键的强制性要求。但是，没有这种相互作用会减慢氧化速度。NATET2突变体不同，后者的5mC氧化几乎完全不反应。在表现出对H键结合伴侣损失的耐受性之后，作者将注意力转移到F27-4m5mC和F27-4dm5mC上（就是在4号位的氨基进行甲基化修饰），它们也可以改变或防止H键形成。由于这些底物不易接受常规的基于MspI的测定，因此作者首先使用ESI-MS探索产物的形成。作者发现F27-4m5mC和F27-4dm5mC上四号位的氨基上的甲基化会被TET2逐渐地去甲基化，并且能够检测到F27-4m5hmC及其后续F27-4m5fC以及F27-4m5caC及其相应4号位的氨基完全去甲基化的产物成。为了更直接地探测N-去甲基化，作者设计了另外两个缺少5-甲基的匹配底物。在与F27-5mC氧化相同的条件下，可以轻松观察到N-脱甲基酶活性。F27-4mC被?30％去甲基化生成F27-C，而F27-4dmC几乎被完全单去甲基化而?30％被二甲基化。因此，TET2具有直接的N-脱甲基酶活性，并且该活性与5-甲基的存在无关。总之，本文在探查5mC识别的核碱基决定因素时，作者发现TET酶还可以作为胞嘧啶碱基的直接N-脱甲基酶。即TET酶既可以充当直接脱甲基酶，也可以充当间接脱甲基酶。这表明Fe（II）/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的活性位点可塑性，并表明在未开发的底物上的活性可能揭示了新的TET生物学功能。
本文作者：LSC
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