你装饰了别人的梦 http://www.fengxiangzhia.com/ycxz/6140.html原理
BCA蛋白定量的方法是基于双缩脲反应，即在碱性溶液中，蛋白将二价Cu2+还原为一价Cu+，一价Cu+被BCA溶液中二辛可宁酸（Bicinchoninicacid）螯合，生成紫色复合物，该复合物在nm处具有强吸收峰。
组分
*Millipore旗下Novagen的BCA试剂盒可测定蛋白质浓度范围为20–μg/ml，根据样品量分为标准型和微型两种形式进行测定。试剂盒组份足以完成次标准型的反应（50μl蛋白质样品加1ml试剂）或2次微量反应（25μl蛋白质样品加μl试剂在96孔板上）。
*为了方便地制备蛋白质浓度标准曲线，提供了牛血清白蛋白（BSA）标准品（2mg/ml）。
稀释BSA标准品
为了确保定量的准确性，建议采用与蛋白样品一样的缓冲液来稀释、配置BSA标准液。如果缓冲液中有干扰BCA的成分，建议用去离子水替代样品缓冲液。
BCA工作液配置
*参考BCA工作液总体积（适用于酶标仪/96孔板的微量测定）：
BCA工作液总体积=（标准品数量+样品数量+空白）×重复数×μL。
举例：如果标准品数量为8，样品数量1，空白数量1，重复数为2，则BCA工作液总体积=（8+1+1）×2×μL=μL
*BCA工作液配制：按50体积的BCA中加入1体积的4%硫酸铜溶液，充分混匀。
举例：将0μL的BCA试剂A与μL的4%硫酸铜溶液混合，得到5μL的BCA工作液。
微量测定（使用酶标仪）
1、吸取25μl标准品或蛋白质样品分别加入到96孔板的各孔中。
2、每孔中加入μlBCA工作液。摇晃均匀30秒。盖上盖子。
3、标准测定：在37°C孵育反应30分钟或在室温孵育2-16小时。
加强测定：在60°C孵育反应15分钟。
4、将板冷却至室温。
注意：虽然在冷却至室温的过程中显色反应仍在继续，10分钟内读取所有反应不会产生显著误差。
5、在酶标仪上测量nm处的吸光度。
注意：如果酶标仪没有nm滤光片，波长在–nm范围内都可以使用。
6、吸光值校正：从标准品和样品吸光值中减去空白管的吸光值。
7、结合已知的BSA标准品的浓度和校正后的吸光值，绘制标准曲线
8、参照标准曲线，根据各蛋白样品校正后的吸光度计算蛋白浓度。
9、根据稀释度和样品体积来计算原始样品中蛋白含量。
除了使用酶标仪和96孔板进行BCA测定，也可以使用分光光度计进行标准定量需要大量的蛋白质样品（50μl）：BCA工作液与蛋白质样品的比例为20：1，因此干扰物质的影响降至最低。
如果在微量比色皿（0.7ml）中读取吸光度，每个反应需要BCA工作液的体积1ml。如果比色皿需要更大的最小体积，则每个反应最多需要3ml试剂。
标准型定量（使用分光光度计）
1、吸取50μl每个标准品或样品到标记好的试管中。
2、加入1mlBCA工作液，轻轻涡旋混匀。
注意：如果比色皿测量时需要更大的最小体积，反应体积可能需要增加到3.15ml（3mlBCA工作试剂加μl标准或蛋白质样品）。
3、标准测定：在37°C孵育30分钟或室温孵育2-16小时。
加强测定：在60°C孵育15分钟。
4、让试管冷却至室温。
注意：虽然在冷却至室温的过程中显色反应仍在继续，10分钟内读取所有反应不会产生显著误差。
5、向干净的比色皿中加入1ml水，在nm调零。
6、将待测液加入干净的比色皿中。
7、在10分钟内测量并记录所有待测液的吸光度（A）。
8、吸光值校正：从标准品和样品吸光值中减去空白管吸光值。
9、结合已知的BSA标准品的浓度和校正后的吸光值，绘制标准曲线。
10、参照标准曲线，根据各蛋白样品校正后的吸光值计算蛋白浓度。
11、根据稀释度和样品体积来计算原始样品中蛋白含量。
问题解答
兼容性
*兼容去污剂（SDS，TritonX-，Tween等）；
*不兼容螯合剂(EDTA，EGTA等)、还原剂（DTT，巯基乙醇等）、脂类、强酸或强碱，会干扰该测定所依赖的还原和螯合反应。下表试剂在浓度很低时也会干扰BCA法进行定量，应该在样品中尽量避免。
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