每一个做过分子克隆的人，都经历过对条带、对转化子望眼欲穿的时刻，除了攒人品，攒人品，每一步的细节更是至关重要。下文为大家分享多年的分子克隆经验。
一、PCR引物设计
通俗地说，很多人用了很多软件设计来设计去，又是考虑发夹结构，又是考虑二聚体，又是考虑Tm值，折腾来折腾去，但其实没那么复杂。
首先保证你要的基因是正确的，从NCBI中找到目的基因的编码区（CDS区），大部分情况下是没问题的。然后再找到起始密码子ATG，从那开始大概上游取20～25bp，加上酶切位点和保护碱基就是上游引物；取后20～25bp碱基，反向互补，加上酶切位点和保护碱基组成下游引物。这样引物设计就完成了，可以放到软件里看看GC含量，Tm值，发夹结构，二聚体等，适当调整碱基个数和保护碱基的个数。需要额外注意的是移码问题。
好用的引物设计软件当然还是首数primer5啦，哈哈，不解释，继续。
二、PCR产物处理
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下酶切连接。对于初学者，我个人强烈建议第二种，连T载体（大神可以直接连接目的表达载体）。
PCR产物直接酶切有两个缺点：
1.由于CDS两端太短，虽说有保护碱基，但还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎。连T载体就不同了，优点是：1.放进T载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。2.酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别。总体来讲连T载体是很有优势的。
2.PCR产物直接酶切的话，无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个或者十几个bp，条带没啥变化。
三、质粒抽提
总体来说，提质粒问题不大，都有试剂盒，按照步骤来，没啥大问题。有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。
四、酶切
用于连接的酶切很关键。需注意如下几点：
1.如果是双酶切A和B，预实验中必须做单切A、单切B、和A+B的双酶切，这两个单酶切的对照可以确认这几种酶是否好用，酶切体系是否work。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。尽量选实验室常用的内切酶。
2.酶切尽量用大体系，如50uL、uL等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。
3.如果要回收、连接，酶切用的DNA量不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。
4.酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低，建议改进体系重新切。
五、回收
回收可以用柱式试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。手工醇沉淀法因其过程复杂，容易损失DNA，故不再赘述。
回收后要跑电泳，一来估算回收液浓度，二来看回收DNA的质量。若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。
六、感受态
做连接要求感受态的效率要高。感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱，而且每次开－80℃冰箱，温度微升对感受态效率都有一定影响，久而久之效率就不行了，这就要求大家取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。制备感受态不推荐新手直接去做，最好由经验丰富者做或他带你做，或者直接购买商业化的感受态成品。用新做的感受态转质粒，用同样手法用量，你会发现比旧感受态明显多长很多克隆。
七、连接
最后才说到连接的问题。连接的问题讨论的往往是比较多的。如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。
1.DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成。当然如果你的DNA质量好DNA用量越大连接效率越高。就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了。
2.vector和insert的比例：如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的几倍长，可以用1：3～1：9。如果insert较长（3～4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector还长，可以用1：1～1：3。短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。长片段的连接效率较低，阳性克隆率小于等于10%是很正常的。我做过一个长片断的连接，6k的vector、6k的insert，比例用1：1，挑了20个克隆有一个对。
3.体系体积：通常用20uL都能连上，若连长片段可以压缩成10uL（前提是DNA数量不变）。我觉得体系不是很关键，有位很精通克隆的老师说他都用50uL体系，照样百发百中。而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的，体系中不加水也行。前述我自己连的长片段也是用20uL体系，vector和insert各上8uL。
4.T4连接酶：酶这东西自然是越贵越好，一分钱一分货，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接，强烈建议买好的。
5.连接时间：过夜就应该足够了，但是你要是不急着转化，放到4度放几天也行，我个人认为时间长只好不坏。
6.连接温度：最适是16℃。有人用PCR仪造16℃，也有人用水浴锅，两种都没毛病。
7.转化：连接的转化不能像转质粒那么随便，要小心翼翼，尽量作到不放弃任何一个菌。一般所用的感受态体积最少是连接体系的5倍。长片段的连接转化时摇菌2小时。
8.对照：对照很关键，可以反应出很多重要的信息，不要懒，你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照。一般有如下几种对照方式：A.转化质粒对照。和连接产物同样抗性、一起转化、涂在同一个板上。这个对照目的是检测转化系统是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量，看长的菌落数，若明显太少就要怀疑感受态）。B.切完回收的vector直接转化对照。如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大，或跑电泳这两种跑不很开，就要做这个对照。目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在。长不出克隆是对的，若长出大量克隆，好好改进你的酶切体系。少量可以忽略C.切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照。双酶切的，最好要做这个对照，而且这个对照长的克隆要挑若干提质粒。若切完的目的vector和没切的vector的长度相差较大，电泳条带离的远，这个对照能检测酶切和回收的质量。如果DNA末端遭破坏或断裂，会随机产生各种末端，这些末端少数能连接到一起，长度上小于等于回收的vector。若切完的vector和没切的vector的长度相差不大，这个对照检测是否有只进行了单酶切的。总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤。
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