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众所周知，去泛素化酶（DUBs）与泛素级联反应具有许多重要的相互作用，其失调与多种疾病有关，包括癌症和神经变性。已知DUBs在几种复杂的酶促网络中运行，并且会被翻译后修饰。因此，体外诱导探针—酶复合物形成的能力在特定时间或在不同的外部输入之后将有助于更好地研究这些酶在细胞内的作用。DUBs具有泛素C末端水解活性，使泛素脱离靶蛋白，从而使得靶蛋白免于降解。至今已经开发出基于活性的探针（ABP）作为研究DUBs的有效策略，包括可渗透细胞的探针、精确识别标记位点的探针和类似于泛素—底物缀合物的探针。然而现有探针在结合后，C末端部分与半胱氨酸活性位点通过亲核攻击立即形成共价键，即使在酶结合之前探针呈现惰性，也无法控制加合物形成的时间。

近期，都柏林大学的JoannaMcgouran教授在ChemicalScience期刊上发表了题为“Probingenzymaticactivity–aradicalapproach”的研究论文。该文章开发了一种基于潜伏活性的探针，使用硫醇-烯策略检测去泛素化酶，并依赖特定的相互作用结合后进行标记。不同于现有的光交联探针，该方法需要一个自由的活性位点半胱氨酸，并且烯烃在环境条件下是完全惰性的，暴露于紫外线下才被激活。与现有的探针相比，实现了酶—探针反应时间控制的可能性。该探针对重组DUB具有反应性，并能捕获细胞裂解物中的内源性DUB的活性。

方案1建立结合平衡后，通过硫醇-烯反应与DUB形成探针的共价键。

使用活化的硫酯中间体生成探针，其结构由人流感血凝素（HA）标签和泛素1-75（Ub75）组成，用一个烯烃基团取代野生型泛素中的C端甘氨酸76位残基。泛素的ABP在环境条件下是惰性的，在暴露于紫外线下后被激活。探头通过酶活性位点内的自由基机制，由引发剂充当主要的自由基来源，并从活性位点半胱氨酸中提取氢，促使探针的C末端和半胱氨酸活性位点之间形成共价键。分析单泛素结合的DUB的晶体结构，显示在结合泛素的C末端有一个空腔。该机制使得探针和靶标酶之间建立结合平衡，随后经历短暂的激活期，从而可以实现现有的半胱氨酸反应性探针无法达到的时间控制。

图1（A）使用MALDI对完整探针1进行MS分析，计算出m/z(M+H)+和(M+2H)2+，发现m/z(M+H)+和(M+2H)2+。（B）探针1的Ub75的C末端肽的LC-MS/MS鉴定。（C）使用12％SDS-PAGE解析纯化的探针1，并使用银染可视化。完整的探针使用MALDI质谱和银染进行表征后，均显示了具有预期分子量的单一蛋白质（图1A和C）；LC-MS/MS将烯丙基酰胺官能团定位在蛋白质的C末端，从而证实了探针的结构（图1B）。

图2用探针1（4μg）标记重组OTUB1（2μg），使用（A）抗HAWestern印迹和（B）银染可视化。重组OTUB1（2μg）在3和4泳道使用探针1孵育前，使用加热或SDS进行变性。在两个凝胶的泳道5中都观察到了一条对应于预期的探针—酶加合物分子量的新条带，如蓝色箭头所示；使用加热或SDS对OTUB1进行变性后，看不到新的条带，证实了在探针和酶的活性形式之间发生反应需要特定的结合相互作用。

图3（A）将HEKT细胞裂解液（50μg）与探针1（1μg）孵育60min，再暴露于紫外线（nm）中一段时间。对照包括使用NEM（10mM），Ub75CH2CH2Br探针（1μg）和除引发剂之外的标记。泳道1中没有可检测的标记，证明了需要进行自由基引发共价标记；第3-4泳道分别暴露1min和10min结果没有明显区别，表明酶和探针1之间的结合相互作用通过调整C末端烯烃预安排反应，使活性位点半胱氨酸被引发攻击；第5-7泳道表明长时间暴露在紫外线下会使样品降解；第9-10泳道裂解物没有降解，表明探针在自由基标记条件下可以通过亲电子和自由基机理发生反应。（B）将HEKT细胞裂解液（50μg）与探针1（1μg）预孵育不同的时间，再暴露于紫外线（nm）2分钟。对照包括无脱气和孵育45min的无活性探针（1μg）。泳道1-5研究了预培养期如何影响标记模式，从20min增加到90min与标记强度的增加相关，在min的时间点观察到下降，表明在90min时结合平衡完全建立；泳道7使用HA-Ub75时没有标记，证明烯烃部分对于形成共价键是必不可少的。

图4（A）将HEKT细胞裂解液（50μg）与浓度递增的抑制剂PR-预孵育90min，然后用探针1（1μg）标记，观察到明显的浓度依赖性的标记强度降低，表明探针1对DUB的特异性。（B）将HEKT细胞裂解液（50μg）与探针1（1μg）预孵育90min，然后以增加的浓度添加抑制剂PR-。（C）将HEKT细胞裂解液（50μg）与Ub75CH2CH2Br孵育并将抑制剂PR-（μM）添加到样品中，将所有样品暴露于UV光（nm）下2min。泳道2和3分别复制B中泳道2和6的条件，仅观察到微小差异，表明DUB抑制剂破坏结合平衡。

图5热图显示单独使用探针1，探针2和裂解物，用抗HA偶联的琼脂糖珠免疫沉淀后，DUB和泛素结合机制的富集。LC-MS/MS分析后，使用无标记定量计算强度。对于每种单独的酶具有最高强度的重复样本被视为％，并且该酶的其他重复样本的值表示为该值的百分比。使用末端烯烃探针1处理过的样品中观察到除了一个已识别的DUB以外的所有DUB的富集，苯基取代的探针2也观察到某些DUB的富集。相比之下，末端烯烃探针1的捕获效率更高。

在本文中，作者成功开发了一种新型的基于活性调控的单泛素探针，该探针在环境条件下是完全无活性的，可以通过半胱氨酸活性位点选择性激活以标记DUB和泛素结合的酶。研究证明了其对重组纯化的DUBOTUB1和HEKT裂解物的反应。这种自由基标记方法具有广泛的适用性，因为任何带有活性位点半胱氨酸的酶都可以此方式靶向，为泛素系统中的反应性和选择性研究提供了更多的机会，可将此方法用于化学蛋白质组学研究。