年，美国PE-Gtus公司人类遗传研究室的Mullis等发现了聚合酶链式反应（polymraschainraction，PCR）。PCR技术具有特异、灵敏、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等优点，得到了广泛的应用。
PCR是分子生物学领域最基本、最重要的技术手段之一。引物设计是PCR技术中至关重要的一环，设计一对适合的核苷酸片段作为引物，高效地从模板DNA序列扩增目的引物，是PCR反应成功的保障。
今天，我和大家一起回顾下引物设计基本知识，希望你能喜欢这方面的内容，并将内容分享给你身边需要的朋友。
一、引物设计流程
序列查找与下载→序列同源性比较→引物设计与筛选→引物加工与修饰→引物的评价分析→引物的二次筛选→引物的最终评估
1.序列查找与下载
根据拟扩增的基因名称或者基因ID，在GnBank数据库或者其它相关数据库中查找有关核酸序列，然后下载。
2.序列同源性比较
主要有两种方式，一是利用在线的NCBI或者其它数据库中的BLAST分析工具进行比较，可将第一步查找得到的核酸序列与序列数据库中所有相关序列进行比较，在结果中可以看到所有相关序列比较的情况，包括同一物种或者不同物种、不同长度的同源序列，另外也可利用在线程序进行序列之间的两两比较；二是可以将查找得到的相关序列利用OMIGA、PCGENE、DNAMAN等软件进行两两比对或者多重序列比较。通过同源性比较，我们可以获得目的基因中高度保守序列片段，从中选择作为PCR扩增的引物。
3.引物设计与筛选
通过一些分子生物学软件（primrprmir5.0）或者在线软件（primr3.0）完成。将目的基因序列输入软件的指定窗口，设置一定的参数，运行程序，即可筛选到若干需要的目标引物。
4.引物加工与修饰
根据不同的实验目的，需要对所设计的引物进行加工修饰，通常在引物序列的5’端添加一定的附加序列，如酶切位点、保护碱基、特异性标签、启动子等。
5.引物的评价分析
为了确保引物的可靠性，通常需要进一步评价分析，常用的引物评价分析软件是Oligo6，它可以弥补引物设计的不足，并对其加以改进。
6.引物的二次筛选
指从初次筛选出的多对引物中进一步筛选出适合的特异、高效扩增的引物。需要注意的两点：一是将得到的一系列的引物分别在GnBank中进行回检，即把每条序列在比对工具中进行同源性检索，弃掉与基因组其他部分同源性比较高的引物，也就是有可能引起错配的引物，一般连续10bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免5-6bp的同源；二是对于真核生物基因而言，以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。
7.引物的最终评估
将设计并筛选得到的引物进行合成，用合成的引物进行PCR扩增以对其进行最终的评估。观察PCR扩增的特异性与效率，也就是是否可以获得特异性条带以及PCR产物的产量如何；观察PCR扩增产物是否与预期六物大小一致；观察是否形成引物二聚体。结合引物最终评估和测序结果对引物成败做出鉴定，为今后进行引物设计积累宝贵经验。
二、引物设计原则
3条基因原则：1.引物与模板的序列紧密互补；2.引物与引物之间避免形成二聚体或发夹结构；3.引物不能在模板的非目的位点引物DNA聚合反应，也就是错配。
实现以上三条原则，要考虑一引物长度、产物长度、序列Tm值、引物与模板形成双链的内部稳定性、形成引物二聚体（duplxformation）及发夹结构（hairpinformation）的能值、引物与产物的GC含量等等。
引物长度一般常在18-30bp，但是应尽量不大于38bp，因为过长导致延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶反应。
引物的特异性也就是引物应在核酸序列的保守区设计，并且与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或者连续8个互补碱基同源。
引物中4碱基的分布最好是随机分布的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的出现，特别是在3’端应避免出现3个以上的G或C，否则会使引物在GC富集序列区错误引发。末位碱基为A，错配效率为会，应尽量避免在引物的3’末端使用碱基A。
引物自身连续互补不能大于3bp，两引物间不应具有互补性，尤其应避免3’末端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
引物的延伸是从3’末端开始的，不能对该位置进行任何修饰。引物的GC含量一般为40%-60%，过高或者过低不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
引物的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。理想状态下，退火温度足够低，以保证引物与目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度为55-70℃，退火温度一般设计定比引物的Tm值低5℃。
引物的△G值。△G值是指DNA双链形成所需要的自由能。该值反映了双链内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。
密码子的简并性。在扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
说了这么多，看累了吧，来点实际操作。
实例分析：使用BLAST设计扩增菜豆豆荚斑驳病*（Banpodmottlvirus，BPMV）RNA2链上的CP基因片段的引物
具体操作：
1.打开NCBI网站：
科学园博雅CC-9号楼2层
