先天性白癜风怎么治 http://m.39.net/baidianfeng/a_4684529.html英文名：EfficientExpressionofanAcidicEndo-polygalacturonasefromAspergillusnigerandItsApplicationinJuiceProduction
作者：JiaojiaoWang,YuhongZhang,XingQin,LingyuGao,BinHan,DeqingZhang,JinyangLi,HeHuang,andWeiZhang
文章来源：journalofagriculturalandfoodchemistry
摘要
利用黑曲霉ZJ5总RNA反转录合成的cDNA克隆一种内源聚半乳糖醛酸酶基因（pga-zj5a）。pga-zj5a的开放阅读框为个碱基对，编码62个氨基酸。以A.nigerZJ5cDNA为模板，成功扩增出缺乏信号肽序列的pga-zj5a，并连接到pPIC9K载体上。将质粒转到毕赤酵母GS的感受态细胞进行外源表达。在L发酵罐培养的上清液中，聚半乳糖醛酸酶的最高活性水平为U/mL。酶学性质测定表明，重组PGA-ZJ5A的最佳pH为4.5，最佳温度为40℃。pga-zj5a对梨汁澄清有效，使梨汁体积增加41.8%，透光率提高倍。
关键词：内聚半乳糖醛酸酶；黑曲霉；毕赤酵母
方法
1.总RNA的提取、cDNA的合成以及pga-zj5a的PCR扩增
2.表达载体的构建
.pga-zj5a在毕赤酵母GS中的表达
4.重组PGA-ZJ5A的纯化与分析
5.酶活测定
6.纯化后的重组PGA-ZJ5A的生化性质
7.底物专一性与动力学分析
8.PGA-ZJ5A在梨汁澄清中的应用
结果
图1：SDS-PAGE分析不同时间点在毕赤酵母中表达的PGA-ZJ5A。泳道M包含标准分子量标记。Lane1为诱导前培养pga-zj5a的pPIC9-PG/GS的上清液，Lane2-7为甲醇诱导后培养24、6、72、84、、12h的重组P.pastoris的上清液。箭头表示重组蛋白。
pga-zj5a基因在P.pastorisGS中成功表达。选择内聚半乳糖醛酸酶活性最高的转化子(摇瓶酶活U/mL)，在L发酵罐中分批补料发酵。在最适条件下发酵12小时，蛋白质的总产率为2.68g/L，最高的聚半乳糖醛酸酶活性为U/mL。
图2：SDS-PAGE分析纯化后的PGA-ZJ5A。泳道M包含标准分子量标记。1重组PGA-ZJ5A的上清液；2纯化后的PGA-ZJ5A蛋白；用Endo-H处理过后去糖基化的PGA-ZJ5A。4来自新英格兰生物实验室的Endo-H酶。箭头表示重组蛋白。
图：纯化后重组蛋白的性质。（A）pH对PGA-ZJ5A活性的影响。在40℃下测定缓冲液pH在2.5-9之间的活性。（B）pH稳定性：在pH2.0-9.0，7℃下培养1h后，在40℃的0.2MNa2HPO4-NaH2PO4(pH4.5)缓冲液下测定其活力。（C）温度对PGA-ZJ5A活性的影响，在pH4.5的0.2MNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液中测定其活力。（D）重组PGA-ZJ5A的热稳定性。PGA-ZJ5A的热稳定性是通过测量在0.2MNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH4.5)中40、45、50和55℃培养不同时期的残留活性来确定。
图4：测定果汁中PGA-ZJ5A的最佳纯化量。（在50mL的梨汁中加入不同剂量的纯化酶（0、1、2、5、10U/mL）。（A）不同剂量纯化酶处理后的梨汁体积。（B）不同剂量纯化酶处理后的梨汁透光率。
图5：PGA-ZJ5A和其他果胶酶在梨汁澄清中的效率。PNL-ZJ5A果胶裂解酶用在1U/mL的梨汁中。纯化后的PGA-ZJ5A用在5U/mL的梨汁中。没有添加任何果胶酶的新鲜梨汁作为对照。
小结
实验从黑曲霉中克隆出一种比活性为.6U/mg的酸性PGA-ZJ5A。与其它类似的实验相比，PGA-ZJ5A在酸性条件下表现出较高的比活性。由于重组PGA-ZJ5Alevel拥有高特异性酶活，高表达量，广泛的酸度(pH4.0?7.0)适应性和在果汁纯化中特定的潜能，其在水果处理过程中会是一种不可多得的拥有宽pH范围的酸性酶。
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图片/来源文章
编辑/关莹
长按
