摘要：目的探究灵芝多糖对盲肠结扎穿孔导致的脓*症急性肺损伤大鼠肺功能及肺组织炎症的影响。方法SD大鼠随机分成对照组、模型组及灵芝多糖低、中、高剂量（50、、mg/kg）组和乌司他丁组，除对照组外，其余各组大鼠均采用盲肠结扎穿孔法制备脓*症模型。给予灵芝多糖和乌司他丁进行干预，采用全自动血气分析仪检测大鼠O2分压[p(O2)]和CO2分压[p(CO2)]；取大鼠右肺中叶计算肺组织湿/干质量；采用ELISA法检测大鼠肺泡灌洗液中白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）水平；采用苏木素-伊红（HE）染色法检测大鼠肺组织病理变化；采用Westernblotting法检测大鼠肺脏组织中Toll样受体4（tolllikereceptor4，TLR4）、p65、磷酸化p65（p-p65）蛋白表达水平。结果与对照组比较，模型组大鼠肺组织结构破坏，肺泡间隔明显增厚，有大量炎性细胞浸润，肺组织炎症评分显著升高（P＜0.05）；肺组织湿质量/干质量显著升高（P＜0.05）；p(CO2)显著升高（P＜0.05），p(O2)显著降低（P＜0.05）；肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均显著升高（P＜0.05）；肺组织TLR4和p-p65/p65蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，灵芝多糖组大鼠肺组织损伤减轻，肺泡完整性较好，炎症细胞浸润减少，肺组织炎症评分显著降低（P＜0.05）；肺组织湿质量/干质量显著降低（P＜0.05）；p(CO2)显著降低（P＜0.05），p(O2)显著升高（P＜0.05）；肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均显著降低（P＜0.05）；肺组织TLR4和p-p65/p65蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。结论灵芝多糖能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，从而减轻脓*症大鼠炎症反应并保护肺功能。
脓*症是感染引起的全身性炎症反应综合征，患者严重时会出现器官功能障碍[1]。肺脏是脓*症患者最易受到损伤的器官之一。脓*症可以引起急性肺损伤（acutelunginjury，ALI），肺组织中大量炎性细胞浸润，免疫炎症反应失衡[2-4]。Toll样受体4（tolllikereceptors4，TLR4）为Toll样受体亚型之一，可通过促进其下游靶点核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）磷酸化活化，介导炎症反应。研究发现，抑制TLR4/NF-κB信号通路可减轻炎症反应，改善脓*症肺损伤[5]。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗氧化、抗病*、抗炎等作用[6-7]。灵芝多糖可通过抑制ApoE?/?动脉粥样硬化小鼠TLR4/NF-κB信号通路，发挥调血脂作用[8]。本研究采用盲肠结扎穿孔法制备大鼠脓*症模型，观察灵芝多糖对脓*症大鼠肺功能的影响，并探讨其对TLR4/NF-κB信号通路的影响，以期为其治疗脓*症提供依据。
1材料
1.1动物
SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，6周龄，体质量～g，购自浙江中医药大学，许可证号SYXK（浙）-。动物于郑州大医院动物房适应性饲养1周，通风良好、温度25℃、相对湿度50%。动物实验经郑州医院动物伦理委员会批准（批准号ZZCH-LL-2072402）。
1.2药品与试剂
乌司他丁注射液（5×U/mL）购自广东天普生化医药股份有限公司；灵芝多糖对照品（质量分数≥90%，批号）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒（批号）、IL-1β试剂盒（批号）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）试剂盒、NF-κB试剂盒购自北京索莱宝生物技术有限公司；TLR4抗体、p65抗体、p-p65抗体、β-actin抗体、羊抗兔IgG抗体购自美国Abcam公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.3仪器
GEM型全自动血气分析仪（美国沃芬有限公司）；GL/i-1SCN型电子天平（德国赛多利斯公司）；MK3Multiskan型酶标仪（美国ThermoFisherScientific公司）；DYCZ-25D型蛋白电泳仪（北京六一仪器厂）；光学显微镜（日本Nikon公司）；无创肺功能仪（法国EMKA公司）。
2方法
2.1脓*症模型的制备
随机选取12只SD大鼠作为对照组，其余大鼠采用盲肠结扎穿孔法[9]制备脓*症模型。大鼠ip1.0%戊巴比妥钠（20mg/kg）麻醉，仰卧位固定，腹部消*脱毛，沿正中腹白线切开皮肤，打开腹腔，找出盲肠，结扎盲肠末端和回盲瓣中间部位，使用18号针头在盲肠结扎处做2处穿刺，轻轻挤压盲肠，挤出部分肠内容物至腹腔，盲肠放入腹腔，逐层缝合，关闭腹腔。术后，大鼠sc生理盐水（30mL/kg）进行液体复苏。对照组大鼠仅打开腹腔，游离盲肠，不结扎穿孔。脓*症大鼠模型制备成功后，检测大鼠肺功能相关指标如潮气量（tidalvolume，VT）、呼气峰流量（peakexpiratoryflow，PET），保证脓*症大鼠模型造成了大鼠肺功能损伤。
2.2分组与给药
按照文献方法[10-11]，将脓*症模型大鼠随机分为模型组及灵芝多糖低、中、高剂量（50、、mg/kg）组和乌司他丁组，每组12只。灵芝多糖溶于生理盐水配制成质量浓度为0.5、1.0、2.0g/mL的溶液。灵芝多糖组大鼠ig相应药物，乌司他丁组大鼠ip药物（3mL/kg），对照组和模型组大鼠ig等体积生理盐水，1次/d，连续14d。
2.3灵芝多糖对脓*症大鼠肺组织湿质量/干质量的影响
大鼠处死后，完整摘除肺组织。取大鼠右肺中叶，吸干表面水分，称定湿质量，于60℃烘箱中烘干48h，称定干质量，计算肺组织湿质量/干质量。
2.4灵芝多糖对脓*症大鼠O2分压[p(O2)]和CO2分压[p(CO2)]的影响
末次给药24h后，大鼠麻醉处死，颈总动脉取血并加入肝素抗凝，使用全自动血气分析仪检测p(O2)和p(CO2)。
2.5灵芝多糖对脓*症大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平的影响
大鼠处死后，打开胸腔，结扎右侧肺部，在近头端气管位置，将预冷生理盐水缓慢注入大鼠左侧肺泡内，然后缓慢抽出，重复3次，将收集的肺泡灌洗液离心取上清，于?80℃保存。按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平。
2.6灵芝多糖对脓*症大鼠肺组织病理变化的影响
取大鼠右肺组织，于4%多聚甲醛中固定，脱水透明、浸蜡包埋、切片后，进行HE染色，于显微镜下观察肺组织病理变化，并对淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润程度进行评分。评分标准：0分为无炎性细胞浸润；3分为部分炎性细胞浸润；5分为大量炎性细胞弥漫性浸润。
2.7灵芝多糖对脓*症大鼠肺组织TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达的影响
取大鼠右肺组织，加入预冷的含蛋白酶抑制剂的裂解液，研磨混匀，离心取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入脱脂牛奶封闭2h；分别加入TLR4、p65、p-p65、β-actin抗体（1∶0），孵育过夜，洗涤后加入羊抗兔IgG抗体，室温孵育2h，洗涤后加入显影液，拍照并观察。
2.8统计学分析
采用SPSS22.0软件统计，计量资料以表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。
3结果
3.1灵芝多糖对脓*症大鼠肺组织湿质量/干质量的影响
如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织湿质量/干质量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，灵芝多糖组大鼠肺组织湿质量/干质量明显降低（P＜0.05），呈剂量相关性。
3.2灵芝多糖对脓*症大鼠p(O2)和p(CO2)的影响
如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠p(O2)显著降低（P＜0.05）、p(CO2)显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，灵芝多糖组大鼠p(O2)显著升高（P＜0.05）、p(CO2)显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。
3.3灵芝多糖对脓*症大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平的影响
如表3所示，与对照组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，灵芝多糖组大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。
3.4灵芝多糖对脓*症大鼠肺组织病理变化的影响
如图1所示，对照组大鼠肺组织形态结构完整，肺泡结构清晰且间隔均一，无炎性细胞浸润；模型组大鼠肺组织结构破坏，肺泡间隔明显增厚，肺间质水肿，可见大量炎性细胞浸润；各给药组大鼠肺组织损伤较模型组减轻，肺泡完整性较好，炎症细胞浸润减少。
如表4所示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织炎症评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠肺组织炎症评分显著降低（P＜0.05）。
3.5灵芝多糖对脓*症大鼠肺组织TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达的影响
如图2和表5所示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织TLR4、p-p65/p65蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，灵芝多糖组大鼠肺组织TLR4、p-p65/p65蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。
4讨论
脓*症是由感染引起的全身反应，是潜在的致命并发症[12-14]。脓*症早期表现为大量促炎细胞因子产生全身性炎症，先天免疫系统对细菌感染产生异常强烈反应[15]。脓*症后期存在广泛的器官功能障碍，肺脏是其主要靶器官[16-17]。本研究采用盲肠结扎穿孔法建立脓*症模型，发现大鼠肺组织结构破坏，肺泡间隔明显增厚，肺间质水肿，可见大量炎性细胞浸润，肺组织炎症评分、肺组织湿/干质量显著升高，肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平显著升高，p(CO2)显著升高，p(O2)显著降低，表明模型组大鼠肺组织严重破坏，炎症反应强烈，肺功能障碍，脓*症模型建立成功。灵芝是我国传统中药，常用于扶正固本、增强身体抵抗能力[8]。灵芝多糖作为灵芝的主要有效成分，可抑制炎症反应、缓解机体损伤[18]。灵芝多糖可通过抑制肝脏组织Nod样受体蛋白3（Nod-likereceptorpyrindomain3，NLRP3）炎性小体相关蛋白表达，减轻急性酒精性肝损伤小鼠的炎症反应，有效缓解肝组织损伤并恢复肝功能[19]。本研究结果显示，灵芝多糖组大鼠肺组织损伤减轻，肺泡完整性较好，炎症细胞浸润减少，肺组织湿/干质量、p(CO2)降低，p(O2)升高，表明灵芝多糖能够改善脓*症大鼠肺损伤，保护肺功能。灵芝多糖可显著降低脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，减轻大鼠脑缺血再灌注继发的炎症反应[20]。本研究结果显示，灵芝多糖组大鼠肺组织炎症评分显著降低，肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均显著降低，且呈剂量相关性，表明灵芝多糖可通过抑制炎症反应，保护脓*症大鼠肺组织。研究表明，TLR4/NF-κB信号通路参与脓*症大鼠炎症反应，姜*素和升降散可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻脓*症大鼠的肠损伤炎症反应和心肌损害[21-22]；紫杉醇可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻脓*症小鼠的急性肺损伤[23]。本研究结果显示，模型组大鼠肺组织中TLR4、p-p65/p65蛋白表达水平显著升高，表明脓*症大鼠肺组织的炎症反应和肺损伤可能与TLR4/NF-κB信号通路活化有关。羧甲基化灵芝多糖可抑制脑缺血再灌注小鼠脑组织中NF-κB表达，从而减轻炎症反应[20]。本研究结果显示，灵芝多糖组大鼠肺组织中TLR4和p-p65/p65蛋白表达水平显著降低，且呈剂量相关性，表明灵芝多糖可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻脓*症大鼠炎症反应。综上所述，灵芝多糖能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，从而抑制脓*症大鼠炎症反应并保护肺脏功能。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
?参考文献（略）
来源：*晗，李凤芝，李杨，张小红．灵芝多糖对脓*症急性肺损伤大鼠肺功能及TLR4/NF-κB通路的影响[J].中草药,,52(8):-.
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