ELISA常见问题及处理方法 [复制链接]

一、概述

ELISA试验以灵敏度较高，特异性较好的特点在临床上、兽药残留检测得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致实验失败。

二、样本的处理

步骤：采样与样品的制备(样品预处理）

提取

净化

浓缩

检测

三、样品制备

(1)样本采集来后应应注意：

1.遵循代表性原则

2.除去不可食部分

3.防止处理样本时被污染

3.如需制成同一样本，应将其混匀后再分次匀将

4.匀将后分袋分装(一般用2号自封袋，每袋约30g)

5.样品储存在-20℃

6.不使用有异味或坏了的样本.

四、药物提取

用溶剂将待测样品中兽药溶解、分离出来的操作步骤。根据样本和待测兽药种类，用不同溶剂和方法进行提取。

*原理：相似相溶。选择与待测兽药极性相似的溶剂，提取剂沸点应45~80℃，且不能与样本发生作用，*性低，价格便宜，必须能溶解待测兽药。对含水量高的样本，一般选与水相混溶的溶剂(乙睛、丙酮等)，要求溶剂对样本有较强的渗透能力，以便能将样本中兽药充分提取。当单一溶剂效果不理想，可选择2种或2种以上不同极性的溶剂，以不同比例配成混合提取剂。

四、提取方法

①振荡法：将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使容器内的样品与提取溶剂充分接触，以深入到样本组织内部提取待测组分。

*振荡方式：

振荡器上进行上下、往返式振荡。手摇式上下振荡

注：1、在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。

②均质法：用均质机对加提取剂的样本快速均质。特点是快速、简便。

③超声法：样本加入提取剂，以超声波提取。

④索氏提取：提取效果好，但时间长，干扰物多。多用于动物样本。

⑤快速混匀法：适用于液体样品。

五、净化

将样本中待测兽药与干扰杂质分离的步骤。原则是尽量完全除掉干扰杂质，而又使待测兽药损失尽量少。但经过提取的待测组分，提取物中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质，这就导致我们在检测过程中出现假阳性。在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法(还可以用吸附柱层析和固相萃取）。

六、浓缩

由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去处全部有机溶剂进行溶剂转换。相当于试剂盒前处理步骤中把样本在60度氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。

一.浓缩方式：

压缩空气吹干除杂

氮气吹干除杂

注意：

1、在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。

2、在吹样本积时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。

3、样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。

4、不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。

二、加样

1.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长

2.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外

3.加样方式(吸二打一）

4.加样后及时放入孵箱

三、孵育

1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发

2.孵育时间不够，导致显示弱

3.孵育时间人为延长，导致非特异性结合

4.孵育时保持温度平衡

四、洗板

1.采用手工洗板，孔与孔之间液体交叉

2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差.

3.反应板过多造成洗板等待时间长

4.洗板次数太多或太少

五、显色

1.显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；

2.加显色剂时溅出孔外造成液体回流

六、终止

.加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加

七、读板

1.读板时板底不清洁.--注意不要将板放在漏有洗洗的地方或不清洁的地方。

2.读板时没有样本的地方也显示出OD值--板底粘了盖板膜或酶标仪设置错误

3.读板时样本颜色很深，打出的OD值很低----酶标仪时间用长，光强变弱或是酶标仪未自检就直接开始打数据

无颜色

1.试剂孵育的时间没有按说明书操作

2.不同试剂盒或不同批号的试剂混用

3.漏加酶

4.HRP酶污染了叠氮钠

5.标准品有问题(标准品有问题）

6.某一容器未洗净，残留灭活酶物质

7.漏加显色剂A或B

8.试剂配制/使用有误

9.缓冲液污染

高背景（本底）

1.洗涤操作不规范

2.实验中孵育温度和时间不适当

3.酶加量过多

4.封闭不完全

5.标本或标准品中的干扰物质

6.显色剂受光照时间较长，或污染

7.整批样品放置时间过长，样品污染

8.缓冲液污染

9.吸头重复使用，未洗净或消*不完全而用于加酶或显色剂

显色弱

1.超过有效期的产品可能会产生很弱的信号

2.加入试剂的体积和时间有误

3.试剂、样品用前未能平衡

4.缩短孵育时间能使实验的信号变弱

5.在温度变化的环境内孵育酶标板

6.使用了被污染的试剂

7.标准品/标本制备方法不规范

8.样本的阳性太高

9.某些试剂盒需要稀释才使用的试剂稀释倍数错误

10.不同批次的试剂盒混用

11.点板时间过长

12.洗板时间过长或过多

13.仪器设定不正确，滤光片不匹配

高CV值

1.板条本身的因素

2.操作不慎或洗涤不充分

3.取样时样本未混匀，样本中正己烷未取净。

标准曲线各点之间OD值区别很小

1.酶结合物不足

2.捕获抗体没有很好结合到板上

3.操作不慎

4.标准曲线稀释度计算有误

5.显示时间不足(个别项目如氯霉素）

精密度：指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近程度，表示分析结果的重复性。常用标准差（SD）或相对标准偏差（RSD）表示。