套索肽(Lassopeptides)是一类由核糖体合成并经过翻译后修饰的活性肽类天然产物(RiPPs)。套索肽具有由C端穿过N端内酰胺环形成的套索结构，其赋予套索肽耐热、抗化学降解和蛋白酶水解等稳定的特性。此外，套索肽具有受体拮抗、酶抑制、抗病*和抑菌等多种生物活性，具有开发为药物或药物先导化合物的潜力。伴随着生物信息学技术的快速发展，套索肽的生物合成基因簇(BGCs)逐渐被挖掘并实现了异源表达，但异源表达等传统的实验方法费时耗力并易受到菌株基因组中其它基因的影响而表达不稳定。近日，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校DouglasA.Mitchell教授团队和美国圣地亚哥Lassogen公司联合创始人兼首席执行官MarkJ.Burk博士联合报道了通过无细胞合成生物学技术(CFB)高效合成套索肽类天然产物的研究。基于这一手段，研究人员探究了fusilassin生物合成过程中的环化酶FusC的底物宽泛性。
首先以报道过的套索肽burhizin(bur)、capistruin(cap)、fusilassin(fus)和cellulassin(cel)为研究对象，运用CFB技术对相应的BGCs进行表达反应，并通过MALDI-TOF-MS、羧肽酶Y降解和热敏实验等对产物进行检测和分析，发现CFB技术可以实现目标产物的合成(Figure1)。此外，通过HPLC、HRMS/MS和荧光蛋白检测等方法发现通过扩大CFB反应体系得到的产物总量显著高于基因簇异源表达的产物量。
Figure1.利用CFB技术合成四种已知的套索肽类天然产物
前期研究发现，fusilassin生物合成过程中的环化酶FusC对不同序列的前体肽具有一定的底物宽泛性，因此对生物合成相关酶进行挖掘和分析，发现将先导肽FusALP分别与核心肽CelACP和HalACP连接，并在CFB体系中与加入fusilassin途径中的酶一起反应时均可得到相应目标产物cellulassin和halolassin(Figure2)，但线性HalA核心肽并未检测到，分析认为可能大肠杆菌提取物中的内源蛋白酶降解了线性肽。通过分析比较2个成功的套索肽合成案例和8个未成功的案例，推测相对于核心肽的loop区域，FusC对核心肽环状区域序列变化具有更高的容忍性。
Figure2.在先导肽FusALP末端连接不同核心肽为底物合成非天然套索肽类化合物
随后，为探究核心肽序列的单个残基是否为FusC环化反应所必需，将核心肽FusA上的16个残基分别突变为Ala，发现优化的CFB技术可以合成野生型套索肽fusilassin及其不同的Ala突变产物(Figure3)。同时发现CFB的反应可能受溶解度、仪器检测灵敏度以及套索肽环化反应和蛋白酶降解反应的相对速率影响而造成套索肽合成或检测受阻。
Figure3.通过对核心肽FusA的单点突变，评估套索环化酶FusC的底物宽泛性
基于上述研究结果，为进一步深入探究FusC的底物宽泛性，研究人员分别构建了核心肽环状区域和loop区域的各5个连续位点的突变体库(环状区域的氨基酸位置为2?6和loop区域的氨基酸位置为10?14)，每个位点用简并密码NNK代替(可组成32个密码子，提供20个常见氨基酸和1个终止密码子)，共设计得到约万个核心肽序列(其中16%的序列包含终止密码子)。选择环状区域分子量为?Da及loop区域分子量为?Da的前体肽作为CFB反应底物，发现得到了/(～52%)环状区突变体和3/57(～5%)loop区突变体(Figures4?5)。选取环状区域个突变前体肽进行CFB反应，发现66%的突变前体肽可形成成熟的套索肽，对其中的10个套索肽进行HRMS/MS和羧肽酶Y降解实验检测后发现其中9个具有螺纹折叠构象和热稳定性。分析了FusC对特定位置的氨基酸偏好性，发现相对于位点3、5的残基，FusC对偶数位点2，4和6的疏水性残基具有中度程度的偏好。最后根据生物信息学分析结果预测了套索肽类天然产物的多样性，通过位点特异性迭代blast搜索发现套索肽的环状区表现出更丰富的多样性。同时发现并非每一种前体肽都可形成成熟的套索肽，这可能与底物-酶共同进化和环境调控等多种因素相关。
Figure4.对核心肽FusA环状区域的连续5个位点2?6的氨基酸残基进行定点突变，得到突变前体肽作为底物进行CFB反应。
Figure5.对核心肽FusAloop区域的连续5个位点10?14的氨基酸残基进行定点突变，得到突变前体肽作为底物进行CFB反应。
综上所述，研究人员建立了用于高效合成套索肽类天然产物的无细胞合成生物学技术CFB，基于该技术合成了种类新颖多样的套索肽，并深入探究了fusilassin生物合成过程中的套索环化酶FusC的底物宽泛性。
DouglasA.Mitchell教授主要从事活性天然产物的挖掘及生物合成研究，并对生物医学领域重要药物或先导化合物的构效关系和作用机制进行阐释(
