今天分享的是年发表在“InducibleexpressionoftrehalosesynthaseinBacilluslicheniformis”海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的诱导表达的一篇文章，通讯作者为GuiyangShi。
麦芽糖可以通过海藻糖合成酶的转糖苷作用大规模转化为海藻糖。而野生型菌株产酶量极低，重组酶在大肠杆菌中表达需要复杂的净化步骤来去除致病物质，然后才能用于食品工业。因此，需要新的方法来工业化生产这种酶。地衣芽孢杆菌因其简单的培养要求和成熟的大规模生产控制策略而成为最受欢迎的载体之一,但需要合适的表达系统。为了克服异源表达的问题，作者开发了一种转录起始可控的诱导表达模式。
首先是重组质粒的构建，作者成功从枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌CC和巨大芽孢杆菌B的基因组DNA中扩增出PxylBs，PxylBl和PxylBm，分别具有不同大小，1.5kb，1.3kb和1.4kb。将扩增子克隆到pHY-PLK载体中，并通过限制酶消化进行验证。随后，从弯曲热单孢菌JCM基因组中扩增出TreS基因，并将该1.8kb片段分别插入到pPxBS、pPxB1和pPxBm载体中，所有构建体均包含用于纯化的N末端His6标签。通过DNA测序验证和分析，得到的PPXBST，pPxBlTs和pPxBmTs显示开放阅读框（ORF）由个碱基对组成。
接下来是TRES的表达，经验证的转化子BlsTs、BllTs和BlmTs经发酵后超声提取胞内蛋白。酶活测定结果表明，海藻糖合成酶在BlsTs、BllTs和BLMTS中得到了功能性表达，其活性分别为12.1U/mL、5.6U/mL和7.2U/mL。SDS-PAGE(10%凝胶)证实了重组海藻糖合成酶的表达。如图1所示、重组蛋白的分子量约为70kDa，与海藻糖合成酶的氨基酸序列一致，其中PxylBsinB在地衣芽孢杆菌B的产率最高，选择构建的BlsTs进行进一步的研究。
数据统计采用了计算复合指标的方法，计算得出各家企业在企业规模、社会影响、发展潜力和社会责任四个维度上的得分，加权平均后确定排名。
图1BlsTs，BllTs和BlmTs产生的粗酶的SDS-PAGE色谱图。10%凝胶显示：泳道1，BLST；泳道2，BLMT；泳道3，BllTs；泳道4，对照；M、蛋白质分子量标记
接下来进行重组酶生产条件的研究，在本研究中，选择了六种底物，即以葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、液化玉米淀粉和麦芽糊精为碳源，构建了pPxBsTs，用于细胞生长和海藻糖合成酶的生产。结果如图2a所示4%麦芽糊精的酶活最高(14.1U/mL)，优于其它底物。
又研究了有机氮源（豆饼，棉籽粕和胰蛋白胨）和无机氮源（硫酸铵和氯化铵）的影响。在五种常见的工业氮源中，发现豆饼优于其他基质0.4%大豆饼的TreS活性最高，为14.2U/mL。底物含有粗蛋白，多肽和游离氨基酸，富含生长因子，可被细菌细胞利用水解。来自该底物的各种元素直接参与氨基酸和蛋白质的合成。
细胞悬液吸光度测定表明，BlsTs在含4%麦芽糊精和0.4%豆饼的培养基中生长良好。在线性阶段开始之前，检测到一个3h的滞后期。生长曲线还表明，细胞在12h后开始退出对数生长期，随后菌株的稳定期将持续至少5h。
图2A不同碳源对重组酶产量的影响，B不同氮源对重组酶产量的影响
接下来用BlsTs细胞进行了一系列诱导实验，以确定诱导剂木糖诱导重组TRES的最佳时间，所有诱导样品经发酵后进行TRES活性和生物量分析。如表1所示，在从指数期向稳定期过渡的过程中，向培养物中添加木糖时，酶活较高。在生长10小时后添加木糖获得20.1U/mL的最大活性。
表1不同诱导剂添加时间对重组地衣芽孢杆菌生长和产酶的影响
然后作者在不同温度(20~40℃)下诱导表达Tres，由于所有诱导都是在指数期开始的，在所有诱导条件下，细胞都经历了进一步的生长，40℃时生物量最高，OD值为21.7，而37℃时活性最高为20.1U/mL。作者又通过对比不同浓度和诱导时间来确定最佳诱导条件在1%木糖诱导下，酶活最高，为22.1U/mL。诱导12h后检测到24.7U/mL的峰值活性。
作者随后研究了重组酶的纯化，BlsTs表达的His6标记的TRES分两步纯化。首先，将g硫酸铵加入mL粗酶液(1L发酵培养的细胞裂解液)中，使其达到35%的饱和度。沉淀物是一种杂质，丢弃。其次，硫酸铵沉淀上清液用磷酸盐缓冲液调节至pH7.5，装入HisTrap色谱柱。亲和吸附后，用0-mM的线性梯度咪唑洗脱结合蛋白。最终得到比活力为U/mg的TrES，纯化倍数达21.1倍，产率为42%(表2)。洗脱的纯化酶清楚地显示出70到kDa标记之间的单一条带(图3)。
表2BlsTs产生的重组酶的纯化
图3BlsTs产生的重组酶纯化的SDS-PAGE层析图谱。采用线性梯度洗脱的方法洗脱His标记的重组蛋白。10%凝胶显示：M，蛋白质分子量标记物；泳道1，流动液；泳道2，50mM咪唑洗脱液；泳道3,mM咪唑洗脱液；泳道4,mM咪唑洗脱液；泳道5,mM咪唑洗脱液；泳道6,mM咪唑洗脱液
最后是用标准实验考察了BlsTs产生的纯化重组TRES在pH6.5条件下的热适应性。最大活性出现在30℃(图4A)，当温度超过50℃时，活性急剧下降。用标准分析方法研究了25℃时的pH分布。该酶在pH7.0时酶活最高，在pH6.3~7.5之间酶活大于最大酶活的70%(图4B)。此外，弱酸性条件(pH5.8)对TRES活性有较强的抑制作用。
图4温度（A）和pH（B）对纯化的重组TRE活性的影响
综上所述，作者利用来自地衣芽孢杆菌的木糖操纵子，构建了三种地衣芽孢杆菌诱导表达系统。枯草芽孢杆菌B.Subtilis、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和巨型芽孢杆菌B.megaterium。这些系统的特性使得海藻糖合成酶基因在食品安全细胞hostB中得到了严格控制和高水平表达。这里提到的系统为芽孢杆菌的基因工程增加了一个可研究的例子，不同来源的启动子其性能稍有不同，可根据这一点来构建单个基因的表达系统。
原文链接：
