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AC:基于AMP头孢菌素酶底物设计与合成以及荧光共振能量转移介导的免疫传感器用于生物传感

引言

在分析科学中，高灵敏度和高稳定性的测量临床样本中低浓度生物标志物的检测方法变得越来越重要。酶联免疫吸附试验(ELISA)由于其高通量和相对低成本的优势，是一种广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测的传统免疫分析方法。然而，一些缺点阻碍了该分析方法的进一步应用。ELISA需要标记酶，通常是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)，这些酶在室温下不稳定，需要低温保存，限制了它们在恶劣环境中的应用。此外，ELISA法的灵敏度有时不能满足复杂基质中痕量目标的检测需要。因此，寻找一种高度稳定的酶来提高检测的稳定性，构建一种与稳定的酶匹配的有效的信号放大系统来提高常规ELISA的灵敏度是一个重大的挑战。许多研究试图克服这些问题。为了提高ELISA的稳定性，人们采用了各种新型酶，如人工纳米酶。然而，选择性不足、重复性低、耐盐性不理想是大多数人工纳米酶面临的共同挑战。因此，有必要寻找其他稳定、催化效率高的生物酶。为了提高分析的灵敏度，采用了许多方法来增强信号读取。纳米颗粒和生物偶联策略被认为是有效的信号读取技术和放大系统。

β-内酰胺酶(β-Lactamase)是广泛存在于结核杆菌中的一种天然生物酶，对内酰胺类抗生素具有显著的降解作用，这是结核杆菌耐药的主要原因。由于其在室温下具有高稳定性和对抗生素高效降解效率，β-内酰胺酶已被广泛用作抗生素去除剂来降解环境中的抗生素残留。此外，通过自然筛选、紫外诱变和抗性筛选，可以在许多革兰氏阴性菌中筛选出高产的β-内酰胺酶菌株，使该酶比其他天然酶便宜。β-内酰胺酶的主要作用位点是内酰胺类抗生素中的β-内酰胺结构motif，这意味着它的特异性底物可以根据作者的要求设计。谢和他的同事制备了一种结构类似碳青霉烯的荧光探针，用于测定碳青霉烯酶活性和产生碳青霉烯酶的生物体。作者小组还开发了一种即时检测牛奶中β-内酰胺酶的通用荧光探针。因此，通过设计和合成合适的底物，β内酰胺酶在免疫检测中可能是一种稳定的标记酶。有效的信号放大系统是提高免疫检测灵敏度的重要途径。荧光共振能量转移(FRET)作为一种强大的信号放大策略已广泛应用于分析科学和生物成像领域。与其他信号放大方法相比，FRET具有较高的荧光传递效率，可增强信号，且具有良好的可设计性，可满足生物传感器的不同要求。作者小组开发了基于β-环糊精修饰的ZnS量子点(β-CD-ZnSQDs)和天然色素3-羟基*酮(3-HF)和中性红(NR)的荧光荧光探针，分别测定葡萄糖和醋酸甲孕酮。结果表明，ZnS-QDs可以通过FRET过程强烈提高受体分子的荧光发射强度。因此，作者希望FRET也能作为一种有效的信号扩增工具来提高常规ELISA的灵敏度。为解决传统ELISA在稳定性和敏感性方面面临的挑战，一种基于β内酰胺酶作为标记酶和FRET信号放大系统的新型免疫分析方法被研究和测试用于检测降钙素原(PCT)(方案1)。为此，Amp头孢菌素酶(AmpC)，设计合成了AMPC特异性底物，该底物由3-醚*酮系β内酰胺组成。为了提高检测灵敏度，将AmpC和PCT检测抗体同时共价吸附在聚苯乙烯(PS)微球上。由于PS微球表面有更多的羧基结合位点，多个AmpC可以结合在PS表面，组成第一个酶信号放大系统。AmpC可催化底物释放报道分子3-羟基*酮(3-HF)，与β-CD-ZnS量子点形成FRET体系。在这个FRET体系中，3-HF作为能量受体，β-CD-ZnS量子点作为能量供体，可以显著增强3-HF的荧光强度(图1B)。因此，3-HF的荧光强度可以作为信号来读出。结合免疫磁分离(IMS)技术，研制了一个AmpC催化的，FRET介导的级联反应免疫传感器(ACF免疫传感器)。该免疫传感器成功地应用于检测真实血清样品中的PCT，并显示了可靠的准确性。

图文解读

图1.ACF免疫传感器检测PCT

为建立酶促反应体系，将AmpC酶的底物设计为MX-66(C31H24N2O7S)，酶促识别段为β-内酰胺环和头孢菌素环，报道分子为天然绿色染料3-HF结构基元。MX-66的合成路线如图2所示。并通过高分辨质谱(HRMS，图S2)、傅里叶变换红外光谱(FTIR，图S1和表S1)和核磁共振(NMR，图S3?S5)方法确认了产物的结构。

图2.底物MX-66的合成路线。

催化反应的机理见图1。当存在AmpC酶时，酶的活性位点(丝氨酸)会特异性攻击β-内酰胺环上的酰胺键，导致酰胺键断裂。β-内酰胺环的开放导致氢化噻唑六方环的电子转移和结构重排，从而释放3-HF。在图3A的MX-66(a),β-CD-ZnSQDs(b),β-CD-ZnSQDs+AmpC(c),MX-66+β-CD-ZnSQDs(d),MX-66+AmpC(e),和MX-66+AmpC+β-CD-ZnSQDs(f)中可以观察到，AmpC酶的底物MX-66几乎没有荧光发射，β-CD-ZnS量子点的荧光发射带约为nm。AmpC酶对β-CD-ZnS量子点的荧光发射无明显影响。当MX-66与AmpC酶混合时，在AmpC的催化下，MX-66释放出3-HF，AmpC在nm左右有一个微弱的荧光发射带。随着β-CDZnS量子点的加入，体系的荧光强度显著增强，发射带红移至nm，这与3-HF与β-CD-ZnS量子点混合后的结果相似。为确定AmpC酶催化反应的机理，收集酶促反应前后底物的HRMS谱图。如图4B所示，大部分底物加入酶后发生反应，M+H+的峰值几乎消失，M+Na+的峰值明显下降。同时出现了几个新的峰值(m/z:.和.)。从准确测定的分子质量和同位素模式可以推断，m/z.为3-HF(M+H+，3-HF的分子式为C15H10O3,m/z:.)，而m/z.为3-HF(M+Na+)。随着AmpC酶浓度的增加，M+Na+(m/z:.)的峰也消失，说明底物的酶促反应已经完成(见图4C)。图S9表明AmpC酶具有良好的稳定性。

图3.酶促反应和FRET体系的荧光表征。

图4.通过HRMS对MX-66酶促反应进行表征

基于上述酶促反应体系，采用多重信号放大策略，研制PCT超灵敏免疫传感器。作者同时耦合AmpC酶和PCT检测抗体在PS微球的表面形成一个PS-Ab2/(AmpC)纳米复合物作为另一个信号放大系统(如方案1所示)。PS微球表面大量的羧基结合位点可以高效结合酶和抗体。信号放大的效果可以通过酶与抗体蛋白的摩尔比来调节。为了方便样品前处理，将PCT捕获抗体与磁性纳米颗粒表面结合形成免疫磁珠(IMBs-Ab1)，免疫磁珠能特异性识别并富集样品溶液中的PCT，形成IMBs-Ab1-PCT复合物。在进行条件优化后，图5A为ACF免疫传感器的荧光光谱，PCT浓度范围为0-70.0ng·mL?1。如图5A所示，随着缓冲溶液中PCT浓度的增加，nm波段的荧光强度逐渐增强。响应信号(荧光强度在nm)和PCT的浓度之间呈现对数关系(见图5b)，检测极限(LOD)估计为0.03ng·mL?1。图5C表明该传感器具有良好的特异性。

图5.ACF免疫传感器的性能。

为了评价ACF免疫传感器检测人血清中PCT的准确性，在健康人血清中添加不同水平的PCT，以评估其加标回收率和重现性。考虑到临床上区分细菌性和非细菌性炎症的诊断标准为0.5ng·mL?1，故PCT的峰值水平选择在0.ng·mL?1到8.75ng·mL?1之间。如表1所示，PCT在人血清中的加标回收率为98.3%~%，相对标准偏差(RSD)为2.14%~12.0%，可满足复杂基质中痕量分析物的检测要求。结果表明，ACF免疫传感器可用于人血清中生物标志物的临床分析。

表1.ACF免疫传感器检测健康人血清中PCT的加标结果(n=3)

采用ACF免疫传医院14份人血清中PCT水平，并采用常规商品化ELISA试剂盒进行验证。图5D和表S2显示了两种方法测量的样品PCT水平。

ACF免疫传感器获得的1、3、8、10、12、14号样品与常规ELISA试剂盒获得的样品具有良好的一致性(相关分析和配对t-检验见图S15)。这进一步说明，所研制的免疫传感器具有较高的可行性来定量人血清中的生物标志物。其他血清样本(编号2、4、6、9、11和13)的PCT水平超出了常规ELISA试剂盒的线性范围(从0.5到16ngmL?1)。因此，酶联免疫吸附测定试剂盒无法准确测定这些样品的PCT水平。而ACF免疫传感器具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，能够准确地提供这些样品的PCT水平(见表S2)。与其他PCT检测平台相比，作者的方法具有更宽的线性范围、相似的灵敏度和更强的选择性（图S3）、更短的检测时间。

总结与展望

本研究设计并成功合成了一种AmpC特异性荧光底物，并开发了一种AmpC催化的FRET介导的用于检测生物标志物PCT的免疫传感器。结果表明，AmpC比传统的免疫标记酶(HRP)更稳定，且AmpC催化的FRET信号放大系统能有效提高免疫传感器的灵敏度。所建立的PCT免疫检测方法具有良好的特异性，可检测血清中PCT的含量，具有较高的灵敏度和准确性。这项工作为开发一种稳定的免疫传感器用于高灵敏度分析真实临床样本中的低丰度生物标志物提供了新的途径。

文献链接

FluorescenceResonanceEnergyTransfer-MediatedImmunosensorBasedonDesignandSynthesisoftheSubstrateofAmpCephalosporinaseforBiosensingAnalyticalChemistry,,91,-