徐琦老师“科研笔记”专题考研人,今天你努力了吗?
日日夜夜PCR,日日夜夜没趋势。今天琦哥就带大家来学习一下恼人的RT-PCR。
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基本概念
cDNA:是一种互补脱氧核糖核酸。与mRNA链互补的单链DNA,以其mRNA为模板,在适当引物的存在下,由mRNA与DNA进行一定条件下合成的,就是cDNA。
反转录:是在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程,合成的DNA链称为与RNA互补DNA,即cDNA。
RTPCR:全称反转录·聚合酶链反应(是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术
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RT-PCR实验目的
检测核酸的表达,主要是RNA的表达,DNA不需要反转录的过程,直接PCR检测即可。
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RT-PCR实验原理
以变性-退火-延伸三个基本反应为一个循环,反复重复这种循环,使DNA得以扩增。
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实验流程
RNA反转录合成cDNA,以cDNA为模板经过变性(让cDNA能够充分打开)、退火(让引物结合到模板DNA上)和延伸(让DNA聚合酶(Taq酶)开始合成DNA,让新的DNA链按照模板的碱基顺序延长下去)等过程扩增出很多的目的片段。
RNA抽提方法:TRlzol法。
主要成分:苯酚
具有裂解细胞和变性蛋白的作用
RNA抽提前准备:
试剂耗材准备(注意RNase)、
细胞和组织样品的准备。
反转录:RNA为模板合成DNA的过程。
在这个过程中需要一个反转录酶,合成的DNA称为与RNA互补的DNA(