年来自自然资源部第一海洋研究所生态环境科学与技术重点实验室的李江在FrontMicrobiol上发表了题为BiochemicalCharacterizationofaCarrageenase,Car,DerivedFromAssociatedBacteriaofAntarcticMacroalgae的研究论文。
Abstract
卡拉胶酶基因car是从南极巨藻相关细菌的宏基因组中获得的。其产物的氨基酸序列与其他卡拉胶酶的相似度高达33%，并含有GH16家族基序。重组Car在大肠杆菌中异源表达，在50°C和pH6.0时表现出最大活性，具有Km6.51mg/ml和Vmax55.77U/mg。其活性被一些阳离子（Na+，K+和Fe2+）增强，但被其它离子抑制（Sr2+，Ca2+，Ni2+，Ba2+，Mn2+，Cu2+，Fe3+，Mg2+)。Car将卡拉胶降解为二糖和四糖。定点突变表明，假定的活性位点E和E，保守位点W和G，在Car活动中扮演重要角色。本研究为生物活性藻类低聚糖的工业制备提供了新的候选者。
01
研究简介
巨藻对全球初级生产做出了重大贡献，并具有重要的工业应用。一些种类的红海藻（Rhodophyta）具有主要由卡拉胶组成的细胞壁。由于卡拉胶具有胶凝和乳化特性，因此它被用作食品，个人护理和化妆品的成分，以及微生物研究的实验室材料。值得注意的是，来自卡拉胶的寡糖具有药理活性，因此它们是药物研究和开发的有用材料。微生物酶降解的低聚卡拉胶比酸水解的低聚卡拉胶更有优势，因为酶以温和的方式与其底物反应并产生具有均匀分子量的低聚衍生物。卡拉胶降解酶不仅用于获得生物活性卡拉胶衍生的低聚糖，还用于生产用于纺织和洗涤剂行业的产品，作为生物乙醇生产的糖化剂，以及作为防止红藻大量繁殖和重复利用藻类生物质的工具。
尽管有大量关于细菌卡拉胶酶的研究，但很少有它们被纯化到均一性，并且大多数都没有很好的特征。卡拉胶酶引起了人们的极大兴趣，因为对卡拉胶的酶降解产物的了解远远少于对琼脂和藻酸盐等其他藻类聚合物的了解。因此，鉴定用于生产生物活性藻类低聚糖的有效微生物卡拉胶，特别是来自特殊环境中的细菌，是一个不断增长的领域，可能会在未来几年产生巨大影响。
南极环境显示出很高的物种丰富度，并具有丰富的特有大型藻类物种。南极大藻宿主复杂多样的微生物群落，在南大洋海洋生态系统的碳代谢中起着重要作用。此外，其他海洋生物很可能利用藻类降解的副产品。此外，这些与大藻相关的细菌是新型和可利用的碳水化合物活性酶的重要来源。
人们对从南极大藻表面发现和多样性分析多糖降解细菌的兴趣日益浓厚。最近的一项研究报告称，南极的一种海洋红藻拥有着具有卡拉胶分解和琼脂分解活性的真菌，这是通过酶分析确定的。然而，据我们所知，以前没有关于从南极细菌中分离出的卡拉胶的生化和功能特性的报告。
直到最近几十年，只有能够自然表达目标酶的可培养微生物才被研究为天然酶的来源。然而，这些生物体及其酶的纯化既昂贵又耗时。现在，宏基因组方法使得从许多不同环境（包括海洋生态系统）中识别生物体和新型生物催化剂的生物多样性变得更加有效。通过使用宏基因组方法，在过去的几十年中，已经从宏基因组中检索了数百种新的CAZymes。然而，最近的基因组和元基因组数据分析表明，关于海洋碳水化合物降解系统的多样性和复杂性仍有很多东西需要了解。
本研究从南极巨藻相关菌的宏基因组中获得了卡拉胶酶基因car，并研究了重组Car的生化特征及其点突变。本研究的结果提供：（1）从南极菌株获得用于CAZymes数据库的aκ-卡拉胶酶基因序列；（2）开发用于利用多糖和巨藻的重组工业酶的有希望的候选者。
02
主要结果
1.Car的多序列比对与系统发育树
从大型藻类相关细菌的宏基因组学数据中获得的推定κ-卡拉胶酶Car具有个核苷酸的编码序列，并编码个氨基酸的蛋白质。SignalP4.1服务器分析的编码Car蛋白的氨基末端有22个氨基酸残基作为潜在的信号序列。基序搜索分析揭示了一个GH16结构域和两个推定活性位点，E和E。在Blast分析中，Car的推断氨基酸序列与来自Zobelliagalactanivoransκ-卡拉胶酶（CAZ.1）具有23.13%的相似性，与来自Pseudoalteromonassp.QYκ-卡拉胶酶（AFV.1）具有25.51%的相似性，与来自Pseudoalteromonastetraodonisκ-卡拉胶酶（BAJ67.1）具有25.82%的相似性，与来自AchromobacterphagephiAxp-3κ-卡拉胶酶（YP_.1）具有33.33%的相似性（图1）。众所周知，卡拉胶酶中有三种糖苷水解酶（GH）家族，根据其氨基酸序列相似性进行分类：GH16（κ-卡拉胶酶），GH82（ι-卡拉胶酶）和GH（λ-卡拉胶酶）。基于卡拉胶酶氨基酸序列的系统发育分析表明，Car与任何已知的GH家族（图2）都有较远的进化关系。结合基序分析（图1）和底物特异性测定，我们推断Car是属于GH16家族的κ-卡拉胶酶成员。藻类相关微生物是发现新型特异性酶和次级代谢物的主要资源。然而，人们对生活在南极海洋巨藻表面的细菌水解的多糖知之甚少。我们的研究结果提供了来自南极巨藻相关细菌的GH16家族成员的序列，以补充CAZymes数据。
图1Car的多序列比对和基序分析：保守的位点用星星标出，Car的预测活性残基用圆点表示，GH16的预测基序用下划线突出显示。
图2基于氨基酸序列的Car与其他卡拉胶酶的系统发育分析，该树采用邻域连接法构造，引导值（以次复制的百分比表示）显示在分支点。
2.Car的表达与纯化
car基因编码具有22个氨基酸信号肽序列的成熟形式的蛋白质，连接到pET30a载体并在大肠杆菌BL21（DE3）中正确表达。SDS-PAGE结果证实0.5mMIPTG诱导其表达。使用Ni-NTAHis标签试剂盒纯化后，根据SDS-PAGE测定，获得对应于40kDa蛋白标记物的单条带。该尺寸与Car的理论分子质量一致（图3）。图3纯化重组Car的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。M列：蛋白质标记物；1列：IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21（DE3）上清液在16°C下培养16小时；2列：重组大肠杆菌BL21（DE3）的颗粒部分，由IPTG在16°C下诱导16小时；3列：纯化Car。
3.Car的生化表征
反应温度和热稳定性是酶在工业应用中非常重要的生化特性。出乎意料的是，Car的最佳温度为50°C（图4A），高于CgkX，CgkS，CgkHC4和CgkZ。尽管Car起源于南极海洋生态系统，但它在60°C仍保持了70%以上的初始活性（图4B)。因此，Car具有高热稳定性，半衰期在60°C下为9小时，在50°C下为24小时。卡拉胶在室温下具有高粘度，是卡拉胶酶降解活性的抑制剂。通常，增加溶解温度用于降低卡拉胶溶液的粘度。然而，大多数已鉴定的卡拉胶酶在40°C以上不稳定。因此，像Car这样的热稳定卡拉胶酶作为在商业规模上生产卡拉胶酶降解产物的新型生物催化剂具有相当大的意义。
Car活性的最佳pH值为6.0，低于大多数其他κ-卡拉胶酶报告的pH值。在我们的实验中，Car在pH10.0时保留了近50%的原始活性，在pH11.0（图4C）保留了40%的原始活性。
金属离子对重组Car的活性有不同的影响。其活性被Sr2+，Ca2+，Ni2+，Ba2+，Mn2+部分抑制，并完全被Cu2+，Fe3+，Mg2+抑制。许多酶的活性受到重金属离子的负面影响，如汞（Hg2+）、钴（Co2+）、锌（Zn2+）、铜（Cu2+）、铝（A13+）和铅（Pb2+），这表明酶的活性可能不依赖于阳离子，这些金属可以改变酶的构象。然而重组Car的卡拉胶酶活性被Na+，K+，特别是Fe2+增强，其初始活性增加了一倍多。在其他研究中，发现钠（Na+）和钾（K+）等阳离子可增加卡拉胶酶活性，特别是高浓度Na+，而碘乙酸，Tween-80和EDTA等试剂对卡拉胶酶活性几乎没有影响。在我们的研究中，Car活性被EDTA完全抑制（图4D），表明金属离子在这种酶的活性中起重要作用。
图4纯化重组Car的生化特性：（A）温度对Car活性的影响（B）重组Car在不同温度下的热稳定性（C）使用不同的缓冲液在50°C下测定pH对Car活性的影响：Na2HPO4–柠檬酸（pH3.0–6.0）、Na2HPO4–NaH2PO4（pH6.0–8.0）、Tris–HCl（pH8.0–9.0）或甘氨酸–NaOH（pH9.0–11.0）（D）金属盐（CaCl2、CuSO4）和螯合剂对Car活性的影响。
4.酶动力学参数
在本研究中，Vm和Km的Car分别为55.77mg/ml·min和6.51mg/ml（图5)。Car的Km低于一些κ-卡拉胶酶，如CgkAJ5，CgkHC4和CgkS，但高于CgkZ（0.84mg/ml）（表1）。酶的Km值越低，其对给定底物的亲和力越高。因此，低Km的Car表明其基质具有高亲和力。图5不同浓度κ-卡拉胶底物（0.01至0.1g/L）纯化重组Car的动力学参数。
表1已报道的κ-卡拉胶酶的生化特征
5.降解产物分析
薄层色谱法是检测不同聚合度寡糖的一种方便有效的方法。从TLC结果中，我们观察到Car将κ-卡拉胶降解成不同聚合度的低聚糖。根据降解寡糖的迁移速率，主要水解产物为二糖（Dp2）和四糖（Dp4）。该系列降解产物与CgkS生产的产品相同，但与CgkAJ5，CgkX，CgkHC4和CgkZ的产物不同（表2）。TLC板上未观察到六糖（Dp6）和具有较高聚合度的六糖（图6)。从30min到12h的水解，Dp4产物变得不那么丰富，而Dp2产物变得更加丰富。这可能意味着κ-卡拉胶首先降解为Dp6，然后Dp6降解为Dp2和Dp4。然而，硫酸低聚糖中硫酸基团的存在对这些寡糖在TLC板上的迁移和分辨率有影响。因此，通过电喷雾质谱（ESI-MS）进一步分析了降解产物。水解30min后产物的质谱具有κ-卡拉胶低聚糖的信号，主要是Dp2，Dp4和Dp6。.11m/z处的峰被分配到二糖[（G4S-An）]?携带一个硫酸基团。.31m/z处的峰被分配到四糖钠盐[（G4S-An）2Na]?携带两个硫酸基团。.25m/z处的峰可能对应于具有三个硫酸根的六糖，携带两个钠离子[（G4S-An）32Na]?（图7A）。在水解12小时后反应混合物的质谱中，仅观察到Dp2（.23m/z）和Dp4（.31m/z）的信号，并且没有对应于Dp6（图7B)。与TLC结果一起，ESI-MS数据表明，κ-卡拉胶首先降解为Dp6，然后Dp6降解为Dp2和Dp4。这些结果显示了Car的酶学性质，其裂解基团为An-G4S单元，产生了一系列具有An-G4S单元的新卡拉二糖低聚糖。先前的研究表明，卡拉胶在κ-，ι-和λ-卡拉胶中切割内部β-1，4键，与报道的卡拉胶相似，Car是一种内切水解酶，属于GH家族。图6重组Car降解产物的薄层色谱图。a、M列：分别为新卡拉二糖（Dp2）、新卡拉四糖（Dp4）和新卡拉六糖（Dp6）的标准样品；0列：对照组，不含Car的κ-卡拉胶孵育60min；15–列：Car与纯化的Car孵育不同反应时间（min）。
图7纯化的Car对κ-卡拉胶水解产物的电喷雾质谱（ESI-MS）分析结果。（A）30min；（B）12h。
6.单点突变分析
蛋白质工程，包括定向进化和理性设计，是改善酶性质的有效技术。为了了解与活性有关的潜在活性位点，残基E和E被Ala或Lys替换。为了探索保守位点对活性的影响，用碱性氨基酸，Lys，Arg或His替换了4个氨基酸残基。结果表明，无论E和E被Ala或Lys取代，还是两者都被Ala或Lys取代，这些突变体的活性都低于野生型Car。这些发现表明E和E在Car的酶活性中起重要作用。相比之下，突变株WK和GK的活性几乎是野生型Car的2倍（图8、9）。这可能是因为Lys具有带正电的侧链，这导致与底物的带负电荷的羧基的结合增强。然而，突变体DK的活性略低于野生型Car，这可能是因为该位点位于活性位点附近。替换对突变体WK和GK的pH适应性几乎没有影响，这两个突变体的最适pH值为6.0（图8）。Xu等人通过定点突变成功地提高了海藻酸裂解酶AlgL-CD的催化效率，并且通过合理设计，XynB和海藻酸裂解酶AlgL的催化活性得到了增强。Wu等人报道，通过一个氨基酸取代与Ca2+紧密结合，可以提高多糖裂解酶的底物亲和力。我们之前的定点突变研究表明，两个Ca结合位点负责琼脂酶Aga3的Ca2+激活和热稳定性。
图8不同突变的平板活性结果。M1-M18对应于表2中列出的突变。
表2Car的突变信息
图9Car及其变体在pH6.0-8.0下的酶活性比较。
03
结论
综上所述，我们获得了一种卡拉胶酶Car，属于GH16家族，来源于与南极巨藻表面相关的细菌的宏基因组。我们的结果表明，重组Car具有比大多数报道的卡拉胶更高的最佳反应温度和更好的热稳定性，即使它来自南极环境。本研究为生物活性藻类低聚糖的工业化制备提供了新的候选药物，为巨藻的有效利用铺平了道路。
原文标题：BiochemicalCharacterizationofaCarrageenase,Car,DerivedFromAssociatedBacteriaofAntarcticMacroalgae
DOI：10./fmicb..
END
前期回顾
来自Persicobactersp.CCB-QB2的一个多结构域褐藻胶裂解酶的功能和结构研究??
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