柠檬明串珠菌是一类从发酵谷物和蔬菜中分离出的革兰氏阳性乳酸菌，该类菌株能表达多种胞外多糖合成酶来合成不同类型的胞外多糖。现有的大部分报道都鉴定出EPS结构，但是对应催化这些EPS产生的酶却研究较少。光明乳业股份有限公司乳业研究院刘景玉对柠檬明串珠菌BD在番茄汁中培养24、72h的发酵液进行硫酸铵沉淀和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原位活性测试。旨在探索柠檬明串珠菌BD菌株中可能催化果聚糖产生的相关酶，建立酶与产物的对应关系。
结果与分析
01
硫酸铵分级沉淀分析
对柠檬明串珠菌BD发酵24h的发酵液和菌体破碎液上清进行饱和硫酸铵分级沉淀，离心后的沉淀溶解后进行Native-PAGE原位活性初步测试。由表2可知，60%饱和度条件下，硫酸铵沉淀的蛋白样品活性测试得到的对应产物条带最亮，40%饱和度条件下，硫酸铵沉淀的蛋白样品活性测试表明能得到少量产物，而饱和度高于60%和低于20%时，硫酸铵沉淀的蛋白样品活性测试几乎看不到产物条带。表明硫酸铵饱和度达到60%时，需要的活性蛋白能被完全沉淀出来。因此选用饱和度60%硫酸铵作为活性蛋白的最终提取条件。在细胞裂解液中未看到明显的产物产生，表明细胞内没有活性蛋白，目标蛋白在细胞外。
02
Native-PAGE蛋白电泳分析
对柠檬明串珠菌BD大量发酵24h和72h后，将发酵液硫酸铵饱和度为60%时沉淀收集的蛋白样品用含4%～20%聚丙酰胺的Native-PAGE胶进行电泳检测。蛋白胶经考马斯亮蓝染色，由图2A可知，经过上述步骤后得到的蛋白混合物中，实验组比对照组在约kDa处多出一条明显的条带，并且实验组24h与72h样品均出现该条带，而对照组则没有出现该条带。表明蔗糖能在番茄汁中诱导柠檬明串珠菌BD产生kDa大小的蛋白并分泌到胞外。在接近kDa的位置，实验组和对照组均有明显的蛋白条带，该条带较宽，可能含有多种蛋白，不能直接从染色胶图中看出差异。kDa处的蛋白是否具有聚合活性还需要进一步实验验证，已有报道中鲜有发现该分子质量的果聚糖聚合酶，葡聚糖蔗糖酶和菊粉蔗糖酶已有与该分子质量接近甚至分子质量更大的蛋白被报道。由于之前的报道中柠檬明串珠菌BD产生的胞外多糖是果聚糖，因此推测该蛋白可能是一个新型果聚糖蔗糖酶。
03
原位活性测试分析
由图2B、C可知，在暗室观察原位活性测试48h的蛋白胶，发现实验组出现3条明显的半透明条带，而对照组则没有出现，这些新出现的条带为被固定在Native-PAGE胶上的酶催化蔗糖底物产生的多糖。其中a条带对应的酶分子质量约为kDa，推测可能对应图2A中的考马斯亮蓝染色条带，而b、c条带对应的酶分子质量约为90、80kDa，未能在图2A对应的位置看到明显的考马斯亮蓝染色条带，可能是由于背景杂蛋白掩盖，或者是该蛋白含量未达到蛋白胶检测限。上述3个大小的蛋白从培养24h样品中开始出现，到培养72h依然存在，且产物条带亮度相似，表明在酸性条件下它们的稳定性较高，发酵后期的pH值接近4.0。以上结果表明，通过60%饱和硫酸铵沉淀的发酵液中的蛋白具有聚合活性，这3个不同大小的酶均能利用蔗糖作为底物产生多糖。由于之前的报道中柠檬明串珠菌BD产生的EPS是果聚糖，因此推测3个蛋白合成的都是果聚糖。
04
多糖产物的单糖组成分析
由图3可知，通过TLC检测可以发现，Native-PAGE蛋白胶上条带a、b、c对应的多糖产物a、b、c均不能在TLC板中展开，而标品葡萄糖和蔗糖均能展开，表明a、b、c均为分子质量较大的多糖产物且不含寡糖和单糖等小分子，从TLC检测结果无法看出多糖产物a、b、c的结构区别。为了增加检测的准确性，将多糖产物a、b、c一起水解，用分析柱检测其单糖组成。由图4可知，与果糖标品对比，3种多糖酸解后的单糖为果糖，表明它们均为果聚糖。由于提取的多糖产物a、b、c含量较少，无法判断它们的聚合度和结构差异。
05
结论
柠檬明串珠菌BD在含蔗糖的番茄汁中能产生果聚糖，但是与之相关的合成酶鲜有研究。本研究通过饱和硫酸铵分级沉淀实验发现，硫酸铵饱和度为60%时能将柠檬明串珠菌BD番茄汁发酵液中的活性蛋白完全沉淀下来，并且合成多糖的活性蛋白存在于细胞外。Native-PAGE后考马斯亮蓝染色发现，实验组多出一条明显的分子质量kDa的蛋白条带。Native-PAGE胶原位活性测试实验发现，沉淀出的蛋白能产生3个聚合条带，分子质量最大约为kDa，另外2个分子质量接近90、80kDa，表明柠檬明串珠菌BD的番茄汁发酵液中含有3种分子质量不同的果聚糖蔗糖酶。TLC和单糖组成分析进一步确定了不同分子质量的蛋白合成产物a、b、c都是果聚糖，目前还不能确定这3个产物在聚合度和结构上是否有差异，3个蛋白的分子质量比目前已报道的果聚糖蔗糖酶分子质量要大，可能是果聚糖蔗糖酶家族的新成员。本研究初步确立了柠檬明串珠菌BD产生的果聚糖与其合成酶的对应关系，为后续果聚糖蔗糖酶的酶活研究提供了参考。
本文《柠檬明串珠菌BD的胞外多糖合成酶特性》发表于《乳业科学与技术》年第1期。引文格式：
刘景玉.柠檬明串珠菌BD的胞外多糖合成酶特性[J].乳业科学与技术,,45(1):15-19.DOI:10./rykxyjs---.
