此方法适用于所有类型的PCR产物，包括那些平末端的和3端携带非模板核苷酸的PCR产物。许多限制性内切核酸酶难以切割靠近DNA分子末端的识别序列，包括由PCR产生的序列(例如，见Jungetal.,;KaufmanandEvans)。
为了避免这些问题，在寡核苷酸引物的5端设计额外的6~8个核苷酸长度的序列。这些序列像夹子一样将扩增DNA的末端结合在一起，为限制性内切核酸酶发挥作用提供“支撑”。
商品供应商的网站中包含关于限制性内切核酸酶切割末端和近末端位点效率的信息(如NewEnglandBiolabs公司)，见信息栏“限制性内切核酸酶及其发现”。如果扩增产物的DNA序列是已知的，可在引物中引入独特的限制性酶切位点。
如果扩增产物的序列是未知的，最好是掺入已知在宿主生物基因组中很少出现的限制性酶切位点。成功用限制性内切核酸酶消化扩增的DNA产物依赖于PCR产物的纯度。
未纯化的扩增产物将受到未使用的引物和PCR过程中产生的引物二聚体的严重污染。此外，扩增产物用限制性内切核酸酶切割后，残余聚合酶和dNTP的继续存在可能会导致平末端DNA的再生。
因此，要想克隆成功，需要在用限制性内切核酸酶切割扩增的DNA之前除去残留的聚合酶和竞争性底物。可以将PCR产物用酚：氯仿抽提后再用乙醇沉淀扩增的DNA.然而，许多研究人员倾向于使用商业化纯化试剂盒
