用于血液接触表面的创新材料的初步血液相容性评估
摘要
多年来，已经创建了几种与血液永久接触的设备（目前正在开发许多其他设备）：机械循环支持就是其中的一个例子。这些装置的血液相容性很大程度上取决于血液接触成分的化学成分。在目前的工作中，提出了一种创新材料（混合膜）来制造脉动心室的内表面：它是通过将合成聚合物（例如，商业聚碳酸酯聚氨酯）与脱细胞猪心包膜偶联而获得的。通过测量其促进凝血酶生成和诱导血小板活化的能力，初步评估了创新材料的血液相容性。我们的研究结果证明了所提出的混合膜的血液相容性。
图形概要
一、简介
最近的技术进步允许扩大几种生物医学设备的临床应用，这些设备可以通过手术植入体内；其中许多必须与血液永久接触。这类装置的例子有全人工心脏(TAH)、心室辅助装置(VAD)、血管移植物和人工机械心脏瓣膜。它们在结构和功能复杂性方面有所不同，但它们必须共享一个共同的约束条件，即血液相容性。实际上，血液相容性涉及几个问题：从没有溶血和血小板活化，到防止细胞成分消耗和凝血途径的激活。血液-生物材料的相互作用非常复杂：它们受控制许多事件的机制调控，其中一些事件尚未完全了解。无论如何，临床实践表明，血液相容性问题会导致出血、溶血、血栓形成和血栓栓塞。在目前的工作中，对一种创新膜的评估进行了说明：它是通过将合成聚合物（商业聚碳酸酯聚氨酯--富临塑胶可提供）与脱细胞猪心包膜偶联而获得的。虽然合成聚合物赋予膜必要的机械阻力，但去细胞组织提供血液相容性。更有趣的是，去细胞组织易于通过循环细胞重新增殖：它将导致体内稳定的内皮化，避免了通常用戊二醛进行化学固定的限制。该膜用于制造具有增强血液相容性的原始心室腔室。
在血液与一个表面之间的第一次接触时，蛋白质的吸附发生：该事件由竞争性交换（Vroman效应）引导，根据它们对给定材料的相对亲和力和它们在本体中的浓度重新分配吸附的蛋白质。最终，吸附的蛋白质介导与血小板和血细胞的相互作用；因此，蛋白质在很大程度上控制着与血液接触的表面的命运。特别是，吸附的蛋白质负责激活血小板和凝血酶的产生。后者是将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的关键酶，纤维蛋白是导致血栓形成的凝血级联的最终产物。血小板也通过聚集参与血栓形成；它们的活动主要与凝血级联的启动有关。血小板在与任何不同于健康内皮的表面接触时都会被激活。特别是，血小板膜上的糖蛋白受体复合物Ib-IX-V可识别暴露的内皮下胶原蛋白，并且通过血管性血友病因子(vWF)，血小板与血管壁结合。此外，暴露的胶原蛋白可以直接与血小板GPIa/IIa和GPVI受体结合。引起血小板活化的另一个刺激因素是它们暴露于循环激动剂：凝血酶就是其中之一。因此，可以通过测量其促进凝血酶生成和诱导血小板活化的能力来初步评估给定表面的血液相容性。
目前的工作旨在评估通过将合成聚合物（血液相容性聚碳酸酯聚氨酯）与脱细胞生物组织（猪心包）偶联获得的创新材料的血液相容性。将该材料（混合膜，DPP-ARLT）的血液相容性与对照、天然（NPP）和去细胞（DPP）猪心包以及单独的聚合物（ARLT：chronoflexAR-LT）进行比较。
二、材料和方法
2.1生物组织的制备
生物组织制备在详细说明。简而言之：健康动物（杜洛克猪，9-14个月大）的新鲜心包由当地屠宰场提供。动物死亡后2小时内，将心包从心脏底部大血管周围的附着物上剥离下来；通过去除胸骨后脂肪和周围的结缔组织对其进行清洁。为了制造混合膜，猪心包从右心室前部区域取出。组织根据TriCol程序进行处理，该程序被提议用于使主动脉瓣脱细胞。在去细胞化过程结束时，将心包样品储存在4°C的抗生素和抗真菌溶液中，其中含有3%青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）和0.25%两性霉素B（CarloErba，意大利科尔纳雷多）。
2.2聚合物和混合膜制造
聚合物以22%(w/v)的N,N-二甲基乙酰胺溶液形式提供。聚合物膜(ARLT)是通过将聚碳酸酯聚氨酯溶液(ChronoFlexAR-LT,CF,富临塑胶可供应联系我们获得详细信息)分配到定制的50×50mm2铝框架中来生产的，然后在80°真空下干燥24小时。完全干燥和冷却后，小心地将聚合物膜从框架上取下。
混合膜(DPP-ARLT)是通过溶液浇铸和溶剂蒸发生产的。将去细胞组织样本置于浆膜侧并固定在50×50mm2的框架上。在另一侧（纤维状）上轻轻倒入体积为5mL的聚碳酸酯聚氨酯溶液。将混合膜在40°C下干燥24小时，然后放入真空烘箱（Raypa，Barcelona，Spain）抽吸。
2.3血液制备
人体血液样本取自一名健康志愿者（女性，28岁）的肘前静脉，该志愿者在抽血前10天禁止服用任何药物。
在含有3.2%柠檬酸钠溶液的Vacutainer试管中收集60mL的血量。
从研究材料（NPP、DPP、ARLT和DPP-ARLT）获得的直径为8mm的圆盘被放置在聚苯乙烯48孔平底板（Sarstedt，Nüm-brecht，Germany）中。在每个孔中吸取μL的血量。假定聚苯乙烯作为阳性对照。
在温和搅拌下将多孔板保持在室温。在30、60和分钟后，从每个孔中采集血液样本。
2.4血小板活化评估
通过流式细胞仪检测血小板表面P-selectin的表达来测量血小板活化。简而言之，在采血后2小时内，将全血与所研究的材料一起孵育。30、60和分钟后，将5微升混合物在45μLHBS缓冲液（0.01MHepespH7.4、0.14MNaCl和2.5mMCaCl2溶液）中稀释，并与滴定抗体CD41a(PE)一起孵育血小板鉴定和CD62p(APC)用于在黑暗中鉴定15分钟的P-selectin。采集前加入一毫升HBS缓冲液。P-selectin阳性计算为CD41a(PE)和CD62p(APC)群体之间的百分比。样品通过CyflowSpace细胞仪采集并通过PartecFloMaxTM软件（Partec，Münster，Germany）进行分析。以慢速采集血小板门控中的20,个事件。
2.5凝血酶生成试验
志愿者的血浆是通过以00rpm的速度将血液离心两次10分钟以去除细胞成分而获得的。
按照Hemker等人的描述对TG进行了研究。在96孔圆底板（ThermoFisherScientific，Waltham，Massachusetts，UnitedStates）中，向一个孔中加入20μL的PPP试剂（组织因子5pmol/L和磷脂4μmol/L），然后加入20μL另一个校准器。两种试剂均由DiagnosticaStago(Gennevilliers,France)提供。向两个孔中加入体积为80μL的血浆。使用校准的自动血栓图(CAT,Thrombino-scopeBV,Stago,UK)对样品进行评估。TG通过在零时间添加荧光底物和钙（Fluka-kit试剂，DiagnosticStago）来引发。荧光记录60分钟，并通过Thrombinoscope软件转换为TG曲线。
2.6数据分析
适用时，通过使用Prism8（GraphPadSoftware，SanDiego，CA，USA）进行的Kruskal-Wallis检验（p值0.05）评估显着差异。
图1血液在研究表面上孵育30、60和分钟后血小板P-selectin[%]的值
三、结果
3.1血小板活化
通过测量与研究材料接触的血液孵育30、60和分钟后血小板表达的P-selectin的量来评估血小板活化。图1显示了通过对在不同时间点测量的不同值进行插值获得的曲线。两个不同的趋势被清楚地识别出来。一方面，脱细胞前后的生物组织NPP和DPP导致P-选择素的快速增加，以%为单位：它在30分钟时从0.36%(NPP)和0.38%(DPP)上升到分钟时分别为1.52%和2.25%。另一方面，对照、聚合物(chronoflexAR-LT富临塑胶可提供)和混合膜(DPP-ARLT)的值从0.16%（时间0的对照）到最大值0.45%(DPP-ARLT)，随着时间的推移略有增加。此外，值得比较图1中曲线的斜率：可以将其视为诱导血小板活化能力的指标。NPP和DPP的斜率分别为1.32和2.05：这些值远高于对照(0.22)、chronoflexAR-LT(0.14)和DPP-ARLT(0.28)。
3.2凝血酶生成
在与研究材料接触的血液孵育30、60和分钟后，获得了三个系列的凝血酶生成曲线（图2）。
图2：血液在研究表面上孵育30(A)、60(B)和(C)分钟后收集的凝血酶生成曲线。凝血酶浓度以nM表示
在每个时间点，对应于不同材料的曲线有很大的重叠。通常，这些曲线显示凝血酶浓度的初始增加，直到达到最大值；然后，曲线迅速下降到基线。根据实验曲线，计算了五个参数。（图3）：它们的值总结在表1到表5中。
图3：CAT方法生成的血栓图示意图及相关参数（滞后时间、峰值、达峰时间、内源性凝血酶电位和速度指数）
关于确定凝血酶浓度达到的最大值的参数“峰值”（表1），除了30分钟后的chronoflexAR-LT，所有材料在0分钟时都表现出低于对照的值。随着时间的推移，所研究材料之间的差异不显着（p值=0.4）：SD值从30时的45.33降至时的11.27。
表1：不同时间点测量表面的峰值
报告平均值和标准偏差(SD)。值以[nM]为单位
“滞后时间”值（表2）的差异并不显着（p值=0.）。在这种情况下，SD值从0.13（30分钟）到0.14（分钟）不等。同样，“达到峰值的时间”值（表3）也没有显着差异（p值=0.）。特别是，SD值从30分钟(0.35)降低到分钟(0.17)。
表2：不同时间点测量表面的滞后时间值
报告平均值和标准偏差(SD)。值以[min]为单位
表3：不同时间点在被测表面上测得的Ttpeak值
报告平均值和标准偏差(SD)。值以[min]为单位
代表凝血酶生成曲线斜率的参数“速度”（表4）在30分钟后达到对照的最大值：所有其他材料显示相似值（p值=0.）：SD值下降时间（从30分钟的23.34到分钟的7.25）。
表4：不同时间点测得的被测表面速度指数值
报告平均值和标准偏差(SD)。数值单位为[nM/min]
参数“ETP”以峰面积计算（表5）：它代表凝血酶的总量。对照获得最高值（在0和30分钟），而所有其他材料显示较低的值，其SD随着时间的推移而减小（从30分钟的到分钟的）。未检测到显着差异（p值=0.2）。
表5：ETP（内源性凝血酶电位）值在不同时间点在所研究表面上
报告平均值和标准偏差(SD)。值的单位为[nM×min]
四、讨论
目前的工作旨在描述一种用于心血管应用的创新材料（混合膜）与其他材料相比的血液相容性。为此，评估了促进血小板活化和诱导凝血酶生成的能力。这种评估只是生物相容性评估整个过程的一部分。
无论如何，采用血液相容性材料并不一定会导致整个设备的血液相容性：它还取决于结构和化学特性、界面表面的生物行为、流动动力学，以及——最后但并非最不重要的——整体设计。最近发表了一篇讨论TAH的血液相容性问题的论文：它详细分析了目前开发的TAH中可能出现的病理生理事件，并说明了预防它们的生物工程解决方案。
唯一与血液完全相容的表面是血管腔内的健康内皮。因此，在血液接触表面上形成的假新内膜可以通过降低导致血栓栓塞并发症的可能性来提高血液相容性。
血小板活化是一种检测合成材料血液相容性的敏感工具。血小板活化可以在接触任何不同于健康内皮的表面时触发：粘附和随后的活化都已通过显微镜测量。在其他研究中，通过评估血小板粘附和补体激活来研究血液相容性。在目前的工作中，通过测量人类血液与不同材料（包括用于心血管应用的材料）孵育后P-selectin蛋白的表达来估计血小板活化。至于血小板活化，所研究的材料表现出两种不同的行为。其中两个，即去细胞化之前（NPP）和去细胞化之后（DPP）的猪心包，诱导了P-selectin的快速增加：这表明去细胞化并没有减少而是增加了生物组织的血栓形成潜力。很容易推测由于去细胞化导致的细胞去除导致胶原纤维的暴露。总体而言，这些数据证实，尽管进行了去细胞化，生物组织仍然是血栓形成的。其他材料，即控制表面、合成聚合物(chronoflexAR-LT)和混合膜(DPP-ARLT)表现类似：它们不会随着时间的推移促进P-selectin表达。因此，合成聚合物的存在消除了血栓形成的潜力去细胞化的组织。
凝血酶生成测定测量血浆样品在体外凝血激活后生成凝血酶的能力。凝血酶生成曲线的特征是一个滞后期，随后是凝血酶的形成和随后的抑制，反映了凝血的三个步骤：起始、传播和终止。凝血酶是凝血过程中的关键酶；凝血性可以定义为产生凝血酶的能力和凝血酶的酶促工作。因此，凝血酶生成测定可以检查血浆凝血能力。在目前的工作中，在血浆孵育30、60和分钟后，在与不同材料接触后评估凝血酶的产生，以比较它们的凝血潜力。根据凝血酶生成曲线为所有材料计算的所有参数未显示显着差异：p值始终0.05。综上所述，结果表明混合膜与血液相容。
五、局限性
本研究的一个局限性是使用单一供体的血液。没有重复是另一个限制。但是，这两种限制都可以通过拟议调查的初步性质来证明。
六、结论
开发创新的TAH以克服目前可用的TAH的缺点仍然是一个具有挑战性的目标：它需要巨大的技术努力（以及金融投资）来设计和制造一种能够再现原生心脏性能的设备。当然，一个关键问题是血液接触表面的血液相容性。目前的工作允许测试一种新型材料（一种通过将商业聚碳酸酯聚氨酯与脱细胞猪心包膜结合获得的混合膜）的血液相容性，该材料仅用于生产创新的心室腔室。在人类血液与混合膜接触时评估血小板活化和凝血酶生成，并将其行为与其他材料进行比较。尽管是初步的，但这项研究表明，混合膜具有可用于生产机械循环支持中的血液接触组件的有前景的特性。
词汇表
ARLT：chronoflexAR-LT
DPP：去细胞猪心包
DPP-ARLT：脱细胞猪心包膜与ChronoflexAR-LT偶联得到的杂交膜
NPPn：天然猪心包
PNI：假新内膜
VAD：心室辅助装置
TAH：全人工心脏
TG：凝血酶生成
