标签：引物设计pcr扩增
PCR实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。其实验方法如下：
试剂准备：
PCR常用的试剂主要包括DNA模板、引物、ddH2O、DNA聚合酶以及特定的反应缓冲液、dNTP、MgSO4（可选）和DMSO（可选）。
二、PCR实验前的准备
在开始PCR实验之前，必须准备好DNA模板（基因组DNA或逆转录制备的cDNA）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)
1.DNA聚合酶。有许多商业DNA聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定DNA片段进行PCR，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的Taq聚合酶。如果要对T-vector连接的片段进行PCR，要注意，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有A-tailing，所以应该选择普通的Taq聚合酶或在PCR实验后添加A-tailing。
2.引物的特异性影响PCR成功的概率，良好的引物设计对PCR扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：
①引物的长度。PCR引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(Tm)。Tm定义为在此温度下，DNA双链体的一半将解离成单链DNA。52-58C范围内的引物Tm是最佳的。
③GC含量。最佳GC含量应为40-60%。
④许多软件可用于引物设计，例如primer5和Oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。
三、实验步骤：
根据PCR使用说明进行试剂混合预配，并设置PCR循环。
简而言之，PCR需要经过以下循环：
1.初始化步骤。这仅对热启动PCR必不可少。此步骤将溶液加热至94-98°C，以激活DNA聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.变性步骤。DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至94-98°C并保持20-30秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链DNA分子。此时进入PCR循环。
3.退火步骤。变性后，反应混合物中的DNA模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约20-40秒以完全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始DNA组装。
4.伸长步骤。在此步骤中，DNA聚合酶开始合成DNA，因此温度应为DNA聚合酶的最适温度。一般选择72°C，但有些酶在68°C时效果更好。这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5到3方向与模板互补，最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标DNA片段的长度和DNA聚合酶的能力。一般来说，DNA聚合酶每60秒产生一千个碱基。
5.2~4步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个PCR过程使用30-35个循环。在PCR循环的早期，PCR产物以指数速率积累，而在PCR循环的后期，随着dNTPs、引物的减少和DNA聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，PCR速率逐渐下降。
6.最终伸长率。30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下最终延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链DNA。
7.贮存。最终产品可以在PCR机器中维持温度在4-10°C。
pcr
