引物设计是分子克隆构建流程中很重要的一个环节，引物设计的好坏直接决定了实验的难易程度，甚至成功与否。吉凯基因累计构建了几万个克隆，积累了丰富的引物设计经验，总结出了一套行之有效的引物设计方法。今天小编就把这些方法分享给大家，希望能为大家的实验工作提供帮助。
一引物设计软件介绍
引物设计的软件有很多，我这里介绍几款大家比较常用的软件。引物设计可以通过PrimerPremier5.0、Oligo6进行自动设计，也可以通过VectorNTI进行手动设计。如果引物设计的位置不固定，比如RealtimePCR，可以使用前者；如果引物设计的位置相对固定，比如，构建一个基因的CDS区，优先使用后者。当然，也可以把这些软件结合起来使用。
二引物设计基本原则
关于引物设计的基本原则，小编就不多说了，网站、论坛上都有很多介绍，主要考虑引物长度、Tm值、GC含量、二聚体、发夹结构、错配等情况。
三引物设计基本流程
在这部分内容中，小编用搭积木的方法教大家“组装”出合格的引物：
?确定目的序列
待构建的目的序列可能是野生型的mRNA、lncRNA、microRNA，也可能是突变型、缺失型或者人为融合的基因，无论是哪种基因，都要先确定构建的序列，才能进行引物设计。
?判断目的序列5’端和3’端是否有重复序列，GC含量是否正常
进行引物设计最怕的就是重复序列和高GC、低GC情况，前者容易产生非特异性扩增，后两者会影响扩增效率。如果有重复序列，设计引物时就要避开重复位置，或者完全跨过重复位置，这样设计的引物对扩增效果影响最小。针对高GC，设计的引物就不能太长，否则Tm值太高，不容易解链。针对低GC，引物就要适当加长，提高Tm值，以使复性条件最佳。
?根据目的基因长度，选择合适长度的引物，并分析引物错配、二聚体和发夹结构情况
一般情况，扩增bp基因的引物长度为22bp左右（这里的引物是指与目的基因匹配的序列），其它长度基因的引物长度做相应调整。然后用PrimerPremier5.0、VectorNTI等软件分析引物的错配、二聚体和发夹结构情况，去除参数不理想的引物，选择合适的引物。
?引物特异性比对
如果PCR扩增时使用的是基因组、反转录的cDNA，就需要在NCBI上使用Primer-BLAST进行比对，确保设计的引物不会比对到其它基因，这样可以提高扩增的特异性。
?融合表达序列调整
相信很多人做的都是真核表达载体，目的基因上游或者下游在载体上需要融合标签或者报告基因，这时候就要考虑读码框的问题了，因为如果读码框不正确，标签或者报告基因就无法正常表达，我们就无法用标签抗体做检测、纯化，也无法看到相应的表型。调整读码框的原则如下：目的基因与融合标签或者报告基因之间的碱基数是3的倍数，而且不能有终止密码子。
?上下游引物加上合适的酶切位点
酶切位点的选择有以下原则：
⑴、针对表达载体，尽量用双酶切位点构建，也不要选择同尾酶，因为如果是同尾酶，比如BamHI、BglII，载体就会很容易自连，目的基因也需要筛选连接方向，就会降低实验成功率甚至实验失败。也尽量不要选择单酶切位点连接，因为载体需要去磷酸化处理，而且也要筛选目的基因连接方向，比较麻烦。
⑵、选择在待构建载体上唯一切点的内切酶，且这两个内切酶距离在20bp以上，这样在载体做双酶切时，相互影响会比较小，从而提高酶切效率。同时选择的内切酶在目的基因中不存在，避免把目的基因切断。
⑶、由于每个内切酶都有最适的酶切buffer及温度，如果做双酶切，尽量选择有共用buffer、酶切温度一致的内切酶，这样做酶切会很方便，酶切效率也比较高。
⑷、由于XbaI，ClaI等内切酶识别位点容易甲基化，尽量不要选择这类内切酶，如果使用的话，需要用甲基化缺陷型菌株制备载体，否则这类内切酶无法切开载体。
⑸、由于NcoI（CCATGG），NdeI（CATATG）等内切酶中含有ATG起始密码子（这里叫起始密码子貌似不太合适，因为不一定从这里开始翻译，姑且这么称呼吧），如果构建表达载体，而且这类酶切位点在目的基因上游，这时在设计引物时，酶切位点的起始密码子与目的基因的起始密码子必须保持读码框一致，否则，翻译有可能从酶切位点的起始密码子开始，下游的目的基因就无法正常翻译。
?加上酶切保护碱基
因为大多数限制性内切酶结合到识别序列时需要一个“扶手”即酶切保护碱基，才能最大限度的发挥作用，因此我们需要在引物酶切位点的5’端增加保护碱基。每种内切酶都有特有的保护碱基，这些保护碱基是通过一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验而最终确定的。
部分酶切保护碱基如下：
至此，引物设计已经完成了，得到如下结构的引物：
需要说明的是，如果是编码氨基酸的基因，可以在起始密码子ATG前增加kozak序列（即GCCACC），以增强翻译效率。
今天就讲到这里，大家是否对引物设计有了更深刻的理解，是否已经掌握了引物设计的流程、方法？如有疑问，欢迎致电咨询。下期继续讲解引物设计的应用---重叠延伸PCR，敬请
