前言
核外体及其必需的辅因子RNA解旋酶MTR4在几种RNA降解途径中起着至关重要的作用。除了解开用于外泌体介导的降解的RNA底物外，MTR4还与RNA结合蛋白结合，所述RNA结合蛋白在不同的RNA加工和衰变途径中起衔接子的作用。7月29日Max-Planck生物化学研究所结构细胞生物学与奥胡斯大学分子生物学与遗传学团队在NatureCommunications查看期刊详情上发表了“TheMTR4helicaserecruitsnuclearadaptorsofthehumanRNAexosomeusingdistinctarch-interactingmotifs”，文章识别和表征人MTR4与核糖体加工适配器NVL和ZCCHC8的相互作用，ZCCHC8是参与小核RNA衰变的衔接子。文章显示NVL和ZCCHC8的非结构化区域包含以互斥方式结合MTR4主要区域的短线性基序。这些短序列与酵母rRNA加工因子的主要相互作用基序（AIM）不同。研究结果表明，核外泌体衔接子已经进化出经典和非经典AIM序列以靶向人MTR4，并证明了MTR4主要结构域可以募集不同RNA结合蛋白库的多功能性和特异性。
研究思路
Figure1：NVL的N端非结构化区域与MTR4KOW相互作用。aNVL和MTR4的域组织的示意图。域边界来自先前的研究以及当前报告中的晶体结构。b蛋白质共沉淀测定。在与谷胱甘肽琼脂糖珠共沉淀之前，将GST标记的MTR4ΔN，MTR4ΔNΔarch和MTR4KOW与Trx-NVL1-或Trx-NVL-一起温育。在用考马斯亮蓝染色的15％SDS-PAGE凝胶上分析总共3％的输入和30％的洗脱液。c使用MTR4KOW和Trx-NVL--（GS）3-eYFP的微尺度热泳实验。总之，将Trx-NVL--（GS）3-eYFP与递增浓度的MTR4KOW一起温育，并通过跟踪NVL-YFP融合蛋白的荧光来测量热泳。
Figure2：通过NMR和定点诱变分析MTR4KOW-NVL复合物。a单独使用MTR4KOW的1H-15N-HSQC叠加或复合六倍于NVL2的复合物。标记了经历大化学位移扰动的选定残基。bMTR4KOW序列每个残基的CSP图。红线标记了重要CSP的阈值，这些CSP映射在面板c中的MTR4KOW模型上。cMTR4KOW结构域，其具有通过NMR指定的标记的二级结构元件和显示显着CSP的残基。d通过下拉分析进行蛋白质共沉淀。将GST标记的MTR4ΔN与Trx-NVL-一起温育，然后与谷胱甘肽琼脂糖珠共沉淀。在15％SDS-PAGE凝胶上分析总共3％的输入和30％的洗脱液，并通过用考马斯亮蓝染色显现。
Figure3：NVL中脊椎动物特异性W-AIM对于结合MTR4KOW至关重要。a代表性NVL序列，Hs，Gg，Xt的脊椎动物特异性插入区域的序列比对，突出显示W-AIM（GWFIDKTP）和Nop53样区域（LFXφD）。b通过下拉分析进行蛋白质共沉淀。在与谷胱甘肽琼脂糖珠共沉淀之前，将GST标记的MTR4ΔN与野生型Trx-NVL-或其指定的突变体一起温育。在SDS-PAGE凝胶上分析。cMTR4ΔN--NVL-复合物的整体结构。d放大MTR4KOW域和NVL之间相互作用的视图。e细胞共同IP分析。FLAG标记的野生型NVL构建体或其指定的突变体变体在稳定表达MTR4-LAP的细胞中瞬时表达。在MTR4-LAP沉淀后，在4-12％SDS-PAGE凝胶上分析总共0.5％的输入和8.0％的洗脱液，然后进行蛋白质印迹分析。
Figure4：ZCCHC8的N末端与MTR4KOW结构域相互作用。aZCCHC8域组织的示意图。从先前的研究和计算序列分析获得域边界。b通过下拉分析进行蛋白质共沉淀.将GST标记的MTR4ΔN，MTR4ΔNΔarch和MTR4KOW与MBP-ZCCHC-一起温育，然后与谷胱甘肽琼脂糖珠共沉淀。c使用MTR4KOW和MBP-ZCCHC--（GS）3-eYFP的微型热泳实验。总之，将BP-ZCCHC--（GS）3-eYFP与递增浓度的MTR4KOW一起温育，并通过跟踪ZCCHC8-YFP融合蛋白的荧光来测量热泳。d使用GST下拉分析技术的竞争实验。将预先形成的GST-MTR4ΔN：Trx-NVL-复合物与递增浓度的MBP-ZCCHC8一起温育，然后用谷胱甘肽琼脂糖珠沉淀。在15％SDS-PAGE凝胶上分析总共3％的输入和30％的洗脱液，并通过用考马斯亮蓝染色显现。
Figure5：通过定点诱变分析ZCCHC8-MTR4KOW复合物。a来自代表性后生动物物种,Hs，Gg，X1的突出的卷曲螺旋结构域和ZCCHC8的锌指之间的区域的序列比对，突出显示NVL样区域，Nop53样AIM和ZCCHC8特异性I-AIM。序列从UniProt数据库获得并使用T-coffee服务器59进行比对。b通过下拉测定法测试ZCCHC-突变体的MTR4ΔN结合能力的蛋白质共沉淀。在与谷胱甘肽琼脂糖珠共沉淀之前，将GST标记的MTR4ΔN与ZCCHC-WT或突变体一起温育。在12％SDS-PAGE凝胶上分析总共3％的输入和30％的洗脱液，并通过用考马斯亮蓝染色显现。c通过拉下试验测试MTR4ΔN突变体的ZCCHC-结合能力的蛋白质共沉淀。将GST标记的MTR4ΔN（WT或突变体变体）与MBP-ZCCHC-一起温育，然后与谷胱甘肽琼脂糖珠共沉淀。在12％SDS-PAGE凝胶上分析总共3％的输入和30％的洗脱液,并通过用考马斯亮蓝染色显现。d细胞共同IP测定。FLAG标记的ZCCHC8构建体利用LAP标签沉淀MTR4后，在4-12％SDS-PAGE凝胶上分析总共0.5％的输入和8.0％的洗脱液，然后进行蛋白质印迹分析。
结论
在这项研究中，文章显示人类核外泌体衔接子NVL和ZCCHC8在表面上结合MTR4KOW结构域，Nop和NRDE-也使用不同的相互作用基序。Nop53/Utp18/Air2，NVL，ZCCHC8和NRDE-2的AIM可以最好地被认为是规范AIM的亚家族。凭借洞察力，NVL和ZCCHC8中的序列乍一看似乎与已知的AIM相似，而是含有可能阻止MTR4结合的单个氨基酸。因此，规范真正的AIM的共有序列可以重新定义为xωxxD（x）1/2G/P，其具有C-末端甘氨酸或脯氨酸残基，其允许多肽链在其远离其结合位点延伸时弯曲。芳香族（ω）和极性/非极性氨基酸可能不同，但往往在规范的AIM的单个亚家族中保守。尽管存在可变性，但所有规范的AIM序列以互斥的方式在MTR4KOW结构域的表面口袋处被识别，其由Arg的存在来定义。因此，该表面袋的突变可以是探测含有相互作用基序的新MTR4相互作用蛋白的有用工具，因为这些基序由于其共有序列的简并性而难以鉴定。此外，文章发现ZCCHC8具有额外的相互作用基序，其不符合规范的AIM共有序列。这些发现表明不同的外泌体衔接蛋白如何以特定和相互排斥的方式进化出相似的机制来识别MTR4，但也可以调节它们最终募集到核外体的亲和力和选择性。
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