北京专业权威白癜风医院 https://mip.yyk.99.com.cn/fengtai/68389/Biosensor-BasedOptimizationofCutinaseSecretionbyCorynebacteriumglutamicum
杂志：FrontiersinMicrobiology
DOI：10./FMICB..
发表时间：年10月
作者：RolandFreudl，PatrickJ.Bakkes
背景：
本文开发了一种具有荧光蛋白编码基因的(eYFP)谷氨酸棒状杆菌作为报告菌株，通过监测与分泌相关的应激反应，从而对分泌的蛋白进行定量，现在进一步证明了这种方法同样适用于腐皮镰孢菌属来源的角质酶的分泌。
研究内容：
1.谷氨酰胺棒状杆菌K9生物传感器菌株结合分裂绿色荧光蛋白检测监测角质酶分泌
作者使用了来自来自枯草芽孢杆菌的信号肽促使角质酶分泌，这里应用了两种信号肽，一种是较强的NprESP，另一种是较弱的PelSP。为了方便检测和定量分泌的角质酶，我们使用了分裂绿色荧光蛋白(GFP)检测，该检测依赖于融合到角质酶C端的GFP11-tag。
2.PelSP-Cutinase-GFP11突变体文库的构建及荧光激活细胞分选筛选及活性测定
用易错PCR方法建立不同的突变文库之后转化于报告菌株。这些突变文库覆盖了角质酶的信号肽区域和N端。采用荧光激活细胞分选(FACS)分离细胞，这些细胞随着蛋白分泌的增加荧光也会增强。其中有5个PelSP突变菌株，他们的分泌的角质酶量和活性增强了4-6倍；两个NprESP突变菌株的角质酶分泌量比之前增强了35%。大多数分离的突变菌株都是在信号肽的h区发生的，这样可以增强信号肽整体的疏水性。
图左为GFP荧光和角质酶活性测定结果。右为将角质酶活性(%)除以GFP荧光(%)得到各突变体的相对比活性。
3.选择性PelSP变异体在补料批培养中的分泌性能
通过对PelSP疏水核心区域的F11I和P16S进行组合突变，其所分泌的角质酶量可以达到NprESP同样的水平。
4.A85V突变对角质酶分泌和活性的影响
此外，筛选PelSP突变文库时还鉴定出了一种具更高比活性的角质酶突变体，这是因为位于底物结合区域的A85V发生了突变。综上所述，应用生物传感器显著优化了谷氨酸棒状杆菌分泌角质酶。由此可知这是一种有价值的工具，也可以应用于其他的分泌蛋白。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
