年3月18日，暨南大学的胡丹团队、高昊团队与德国波恩大学的JeroenS.Dickschat团队合作在ACSCatalysis上发表了题为MechanisticCharacterizationoftheFusicoccane-typeDiterpeneSynthaseforMyrothec-15(17)-en-7-ol（用于催化合成Myrothec-15(17)-en-7-ol的Fusicoccane型二萜合成酶的特性）的文章。这篇文章报道了一个从Myrotheciumgramineum中新发现的Fusicoccane型二萜合成酶——MyrotheciumgramineumMyrothec-15(17)-en-7-olSynthase(MgMS)，其可以催化一种全新骨架的二萜醇类化合物——Myrothec-15(17)-en-7-ol的合成。在解析化合物合成途径的过程中，作者利用密度泛函理论计算(DFT)发现了一种不同于以往去质子化/重质子化的质子迁移机制，即以H2O介导的质子迁移。第一作者：Fu-LongLin,LukasLauterbach,JianZou通讯作者：DanHu,HaoGao,JeroenS.DickschatDOI:10./acscatal.0c背景：Fusicoccane(FC)型二萜以5?8?5三环骨架为共同特征，分布于真菌、细菌、苔藓和高等植物等中。FC型二萜具有多样的生物活性，比如，fusicoccinA和cotyleninA通过靶向细胞膜H+-ATP酶表现出较强的植物*性。已有超过种FC型二萜被报道，这些二萜在立体化学上具有不同的骨架、官能团和不饱和基团。FC型二萜的三环骨架由GGPP两步连续的1,11?10,14?环化和2,6?环化形成。由于C10和C13位C?C键通常是anti构型，所以两步环化后会有16个可能的结构生成，由此推断理论上FC型二萜合成酶可被划分为16个亚型。目前FC型二萜仅发现了3个亚型(PaFS,AbFS;SdnA;CotB2,AcOS)(Fig.1)，具有广阔的探索空间。Fig.1.已被报道的（黑色）与文章中新发现的（红色）FC型二萜及其合成酶。结果：作者通过基因挖掘，在MyrotheciumgramineumZLW?19中发现了一个编码预测含有个氨基酸蛋白的基因。系统发育分析证明该蛋白与PaFS、AbFS属于同一分支，为FC型二萜合成酶。作者将该酶的基因导入到AspergillusoryzaeNSAR1表达系统，表达得到化合物7。高分辨率质谱(HRMS)与核磁共振一维谱和二维谱确定了化合物7的结构。核磁共振ROESY谱表明化合物7是一个立体化学上不同于先前报道的FC型二萜，其被命名为myrothec-15(17)-en-7-ol。催化其合成的二萜合成酶被命名为MyrotheciumgramineumMyrothec-15(17)-en-7-olSynthase(MgMS)(Fig.1)。起初，NMR信号重叠阻碍了化合物7立体构型的解析。结合13CNMR计算理论数值和实验数据的比对，作者最终确定了(2S*,3S*,6R*,7R*,10S*,11R*,14R*)-7的相对构型。通过振动圆二色光谱(VCD)和密度泛函理论计算(DFT)得到了(2S,3S,6R,7R,10S,11R,14R)-7的绝对构型。作者进一步构建了含有MgMS基因的大肠杆菌表达系统，利用氘取代的(E)-and(Z)-(4-13C,4-2H)IPP和(R)-and(S)-(1-13C,1-2H)IPP，最终确定了化合物7的绝对构型(Fig.2)。Fig.2.同位素标记实验确定化合物7的绝对构型。作者基于PaFS的晶体结构，通过同源建模在MgMS活性中心发现了6个与PaFS不同的氨基酸残基。将这6个氨基酸残基分别更换为PaFS中相应的氨基酸残基后，作者发现YW变体丧失活性，IF变体转而生成一种新的二萜化合物8(Fig.3)。NMR分析显示8与7的不同之处在于8的C7和C8间存在一个双键而7的C7上为一个羟基。Fig.3.化合物8的结构式。作者推测了化合物7和8可能的合成途径(patha)：GGPP经历1,11?10,14?环化后得到A+，A+去质子化，得到一个从未被报道过的二萜化合物—中性中间体9。9的C3位质子化，发生2,6?环化得到C+。H2O进攻C7最终得到化合物7(Fig.4)。由于9无法像作者之前研究的中间体一样被捕获，所以作者在接下来的研究中试图证明9是否是合成途径的中间体并解释其不能被捕获的原因。Fig.4.由GGPP到化合物7和8可能的合成途径。作者参考之前的研究，重新预测了一条没有中间体9参与的合成途径(pathb)。在这一途径中，A+C16或C17位上的质子迁移到C2得到中间体B+，再发生一步1,2?氢迁移和2,6?环化而得到中间体C+。密度泛函理论计算揭示了中间体A+的最优结构(Fig.5)。作者假设如果C14?C15单键的旋转被MgMS的活性位点限制，那么C17上的H与C16相比更适合作为氢供体，此时C2与C17上H的距离为3.77?。但是C17上C?H键的方向并不理想，不利于与C2和C3间的π键重叠，这预示着可能存在一种与直接分子内质子迁移不同的迁移方式。由于终产物由水合作用产生，因此作者猜测一个或多个水分子存在于酶活性位点附近，并参与介导质子迁移。当一分子H2O以氢键与17?甲基连接时(A+_1W)，H与C2的距离依旧太远（3.61?），方向也不合适。在A+_2W中，后引入的H2O与先前引入的H2O之间形成氢键，并且其O?H键的方向几乎与C2?C3间π键的方向平行，这是一个理想的状态(Fig.5)。由此作者推断C17位上的质子迁移到C2可能是由两分子H2O所介导。Fig.5.B3LYP/6-31G(d)优化的关键活性中间体结构。作者通过反应过程中的自由能来检验上述假设的正确性(Fig.6)。他们发现从A+_2W到9_2W后，经由一步能垒很小的过渡态TS2，9_2W马上反应成为B+_2W。9_2W的瞬时性解释了9不能被捕获的原因。进一步的同位素标记实验证明17?甲基是反应最初的氢供体，C14?C15单键的旋转受到酶的限制。作者虽然在结论中不排除活性位点氨基酸残基参与质子迁移的可能，但认为那不是必需的，因为H2O介导的质子迁移需要跨越的能垒更低。Fig.6.反应过程中的自由能。结论：通过基因挖掘，本文作者在MyrotheciumgramineumZLW?19中新发现了一个二萜合成酶MgMS，并得到了其催化产物myrothec-15(17)-en-7-ol。本研究的关键是作者预测了两条myrothec-15(17)-en-7-ol的合成途径，猜测两分子H2O参与到质子迁移中，从而引起接下来的环化反应。作者通过密度泛函理论计算、反应过程中的自由能变化和同位素标记实验验证了他们的假设。最终，本研究发现了一种不同于以往去质子化/重质子化的质子迁移机制，即以H2O介导的质子迁移，这为阐明萜类化合物的环化过程提供了一种新的思路。更多与MgMS催化机制相似的二萜合成酶还有待进一步挖掘。对我们工作的启示：在酶的催化机制的研究中，要大胆假设、小心求证。在证据支持还不充分的情况下可以先抛出一个观点，再结合严谨的多个实验设计验证假设的正确与否。这一点也可以延伸到不同的研究和研究的不同环节中。
编辑
孙鑫
排版
LYJ
审核
贾美荣
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