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背景[1-3]
17Β-雌二醇(17Β-E2)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中17Β-雌二醇(17Β-E2)水平。
实验原理
17β-雌二醇（17β-E2）ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被17β-雌二醇（17β-E2）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的*色。颜色的深浅和样品中的17β-雌二醇（17β-E2）呈正相关。用酶标仪在nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
17Β-雌二醇(17Β-E2)ELISA试剂盒
样本处理及要求
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将匀浆液于×g离心5~10分钟，取上清检测。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
应用[4][5]
用于绒山羊毛囊体外培养及雌二醇对毛囊Bcl-2、Bax表达的影响研究
以绒山羊毛囊体外培养为基础,并比较了不同培养基对毛囊培养的影响;利用组织法和消化法进行了毛乳头细胞的分离、培养、传代和冻存;通过对游离绒山羊初级毛囊和绵羊毛囊的培养,观察不同毛囊各生长阶段的组织结构特征;应用绒山羊毛囊体外培养模型研究雌激素对体外绒山羊初级毛囊生物学特性的影响;又进一步从分子生物学水平,利用体外培养的绒山羊皮片研究雌激素对Bcl-2、Bax基因表达量的调节作用。
试验结果如下:1.对传统分离方法进行改进,参照Philpott[55]的方法,通过显微解剖法和切割法的结合,将绒山羊皮肤剪成大约（3～5）mm×10mm大小的皮片（只含单层毛囊）,当毛囊宽度适宜时可以获得更多的游离毛囊,应选用外毛根鞘完整、毛乳头形态圆润光滑的生长期毛囊进行培养。同时为了便于观察和测量以及毛囊的生长,我们认为分离后的毛囊长度约为2～3mm时最适合毛囊的生长和观察。
2.成功进行了游离毛囊的体外培养,并发现初级毛囊在含血清DMEM培养基中生长速度缓慢,扭曲变形早,平均在4天左右开始贴壁;而使用无血清DMEM培养基初级毛囊生长天数明显延长,毛囊的层次结构及形态可长时间保持不变,但从第2天开始生长速度与含血清培养时无明显差异（P0.05）;使用WilliamsE无血清培养基初级毛囊在前5天生长速度明显加快,而初级毛囊在WilliamsE无血清无转铁蛋白培养基中生长速度较WilliamsE无血清培养的慢,但毛囊存活时间与在WilliamsE无血清培养基中的无明显差别（P0.05）,说明转铁蛋白有助于毛囊的生长和形态的维持。实验证明WilliamsE无血清培养更适合于绒山羊毛囊的体外培养。
3.利用WilliamsE无血清培养基对绒山羊次级毛囊进行培养,前3天的平均生长速度为0.mm/d,接近于绒山羊体内绒毛同期生长的平均情况（0.mm/d）,但次级毛囊的生长时间有限,维持时间短。
4.对不同时期初级毛囊进行体外培养,结果发现11月份的初级毛囊前3天的平均生长速度为0.08mm/d,与体内初级毛囊同期的平均生长情况相同（0.08mm/d）,且体外培养单天生长速度最大值（0.09mm/d）大于体内单天生长速度的最大值（0.mm/d）。生长情况好于体外9月份的生长情况,与初级毛囊在体内的活性在9月份达到最高峰相反,由此可以推断毛囊的活性与温度密切相关。
5.利用胶原酶消化和机械分离相结合的方法分离处于生长期的内蒙古绒山羊初级毛囊毛乳头细胞,并成功培养。在倒置显微镜下毛乳头细胞呈成纤维细胞形态,具有多层凝集特性。
6.对体外游离山羊初级毛囊与绵羊毛囊的生长进行比较。在培养过程中,绵羊毛囊的日平均生长速度明显高于绒山羊毛囊的生长速度,但各自在前3天的生长均能保持相对稳定的水平,并与体内毛囊的生长速度接近。随着培养时间的延长,绵羊毛囊的生长速度急剧下降,而绒山羊初级毛囊在前9天的生长情况始终较为稳定,毛囊形态变化较规律。#试剂盒#
参考文献
[1]TheAndrogenReceptor:Structure,Mutations,andAntiandrogens[J].SamitHirawat,DanielR.Budman,WilliKreis.CancerInvestigation.(3)
[2]Theexpressionofinsulin-likegrowthfactor1infolliculardermalpapillaecorrelateswiththerapeuticefficacyoffinasterideinandrogeneticalopecia[J].LirenTang,OlgaBernardo,ChantalBolduc,HarveyLui,ShabnamMadani,JerryShapiro.JournaloftheAmericanAcademyofDermatology.(2)
[3]Oestrogenreceptorbetaisthepredominantoestrogenreceptorinhumanscalpskin[J].ExperimentalDermatology.(2)
[4]AnOverviewofReal-TimeQuantitativePCR:ApplicationstoQuantifyCytokineGeneExpression[J].AnnapaulaGiulietti,LutOverbergh,DirkValckx,BrigitteDecallonne,RogerBouillon,ChantalMathieu.Methods.(4)
[5]李蘅.绒山羊毛囊体外培养及雌二醇对毛囊Bcl-2、Bax表达的影响[D].内蒙古农业大学,.
