北京的医院治疗白癜风 http://www.baidianfeng111.org/m/作为生物学研究领域的必备实验技能
#人生的高光时刻#WesternBlot(蛋白质印迹法)
在线折磨着一代又一代科研小白
从组织研磨到样品制备、蛋白定量
每个经验丰富的实验老手
以上步骤中的坑
几乎都要踩上一遍
“科研生涯走过最长的路,就是WB实验的弯路...”
每个生物专业的科研党
都有着一本厚厚的WB血泪史
一个个二十出头的小青年
被这位「中年大叔」整天按在地上摩擦
虽然是一个基础实验
但却是自然科学领域罕见的“玄学”操作
实验时间长、操作细节多
有时就算凑齐天时地利人和
也不一定能得到一组完美的条带
实验本身已经够难了
但是总是牵涉进
“造假”、“撤稿”、“学术不端”等丑闻
使得主流期刊对文章中WB数据的要求越来越高
众多杂志都要求作者提供相关的原始数据
甚至要求作者提供未切割的WB全膜条带
尽管WB实验这么玄
但有的坑还是可以规避的
今天就跟大家分享下
WB实验中你一定要避开的“坑”
如何拿到漂亮的WB结果!
重点来了
重点来了
VE-转移电泳槽是用来对少量核酸及蛋白质样品进行转移电泳的装置
操作简便,方便环保
创新设计,同时可以转印四块凝胶
做到一槽多用,可节省实验空间和经费
性能特点
槽体采用高强度和高透明度的聚碳酸酯材料注塑成型,免除液体渗漏的困扰。
多重安全设计,免除了可能产生的操作安全问题。
安全按钮式的开盖设计,方便电泳槽盖的开启。
专用开启式转移胶架,操作方便。
可同时转印四块9×9cm凝胶
专用蓝冰盒可反复使用,方便环保。
转印时间为15-60min,也可选择低电压过夜。
可以与VE-微型垂直电泳槽配套使用
流行外型设计,精品理念,超越国外同类产品同样水平。
具体课程介绍详见后文或戳图片链接
#后续会有更多干货哦#
蛋白质的提取
提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶抑制剂)。
蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存,不要反复冻融。
蛋白浓度低时,可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。
提高跑胶质量的Tips
小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55V,分离胶75V就能跑得很好,但是实验的时间会很长。
胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀(不要有气泡),玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶。
内参的选择
做全细胞和细胞质的WB实验时,选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时,由于HistoneH3是染色体的组成型表达组分,表达相当稳定,并且特别好跑,可以算是细胞核内参的首选。
针对一些特定的内参,蛋白上样量超过一定的量时,出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin,当上样量超过20μg时,条带灰度不会呈线性的增加。因此,在做WB校正时,调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。
电泳中常见现象的处理
条带呈笑脸状:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;电泳系统温度偏高,而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形,所以因为赶时间而加大电压可能会出现这个)。应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶抑制剂)。
条带呈皱眉状:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。
条带拖尾:样品溶解不好,或存在一定程度地蛋白降解。
纵向条纹(纹理条带):样品中含有不溶性颗粒,可能抽提蛋白时出了问题。
条带两边扩散:加样量过多,弥散至孔周围了,减少上样量或者使用5X上样缓冲液。
WB结果中背景较高
膜封闭不够,建议延长封闭的时间;选择合适的封闭液
一抗稀释度不适宜,太高,选择最适宜的抗体稀释度,或者是一抗孵育的温度偏高,建议4℃过夜孵育。
膜的选择有问题:选择的膜容易产生高背景,一般NC膜的背景会比PVDF膜低,但是NC膜吸附力也就差了一点,膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过,实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。
检测时曝光时间过长,可减少曝光时间
WB结果信号弱或无信号
你所检测的样本中有不表达目的蛋白,选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性,检测样本低表达目的蛋白,提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。抑制剂)。
一抗孵育时间不足,建议4℃结合过夜,或者是由于二抗与一抗不匹配,选择针对一抗来源的种属的抗体。
洗膜过度,洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。