表达CP4EPSP合成酶的转基因马铃薯 [复制链接]

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年10月8日，植物学领域主流期刊PlantCell,TissueandOrganCulture杂志在线发表了题为"TransgenicpotatolinesexpressingCP4?EPSPsynthaseexhibitresistanceagainstglyphosate"的研究论文，该论文将抗草甘膦性状引入四个马铃薯品种(LadyOlympia,Desiree,AgriaandGranola)，由这些栽培品种推定转基因植物对草甘膦具有较强的抗性，这些转基因马铃薯品系也可作为高效马铃薯育种计划的种质资源。

马铃薯作物从出苗到冠层关闭期间特别容易受到杂草的竞争，并且会遭受显著的产量损失。草甘膦是一种广谱除草剂，在世界范围内用于控制杂草。为了将抗草甘膦性状引入四个马铃薯品种(LadyOlympia,Desiree,AgriaandGranola)，采用叶片和节间外植体进行了高效、低成本、可重复和稳定的农杆菌介导的遗传转化方案。用农杆菌LBA感染外植体，该菌株在花椰菜花叶病*35S启动子的控制下含有新修饰的含EPSP合成酶基因的重组二元载体PCAmHe-EPPS。总转化效率为26.4%。在转移到温室的株植物中，发现74株植物与感兴趣的基因呈聚合酶链反应阳性。GUS组织化学、Southern印迹、RT-qPCR、侧流试纸条分析证实了EPSPS在初级转化体中的整合和表达。在T0和第一代块茎中，由这些栽培品种开发的推定转基因植物对草甘膦应用具有增强的抗性。这些转基因马铃薯品系可作为高效马铃薯育种计划的种质资源。

遵循标准的分子克隆方案，pCAMBIA被修饰为pCAMBIA-EPSPS，以从叶盘和节间外植体开发抗草甘膦转基因马铃薯。遗传转化的不同阶段如图2所示。在质谱培养基中寻找草甘膦最佳浓度的实验显示，随着浓度的增加，出现了褐变和坏死，在浓度为2.0和2.5毫摩尔的质谱培养基中无法存活。然而，外植体在不含草甘膦的质谱培养基中存活并再生(数据未显示)。1.5mM的浓度导致外植体部分/完全死亡，因此1.5mM被确定为适合于进一步的体外研究。

图2马铃薯品种在抗性愈伤组织上的再生:a.从在优化的抗性愈伤组织上的Agria的叶盘外植体获得的抗性愈伤组织的芽再生，b.从Agria的抗性愈伤组织获得的芽再生，c.从LadyOlympia的节间外植体获得的芽再生，d.从LadyOlympia的愈伤组织获得的再生芽再生，e.具有发达的根的再生植株和f根良好的植株

当在再生的不同阶段进行GUS组织化学分析时，初级转化体显示出蓝色斑点，表明gusA基因的功能性(图3)。未转化的植物用作阴性对照。总的来说，节间外植体给出了有希望的结果。

图3在马铃薯转化的不同步骤进行的GUS组织化学分析:5d后RSM上的对照和抗性节间，b叶外植体，c对照和抗性愈伤组织，d对照和抗性再生芽，eGUS在体外推定的转基因植物中后期的表达。

Southern杂交证实了聚合酶链反应阳性植物中EPSPS基因的整合。当与EPSPS基因探针杂交时，转化体显示阳性信号。阴性植物中未检测到信号。以改造后的质粒为阳性对照。检测到转基因A-20、LO-72和G-35的一个拷贝(图4)。

图4聚合酶链反应阳性转基因植物的Southern印迹分析。在A-20、LO-72和G-35(泳道4、6和8)中检测到转基因的一个拷贝，泳道1ambaHindIII标记，泳道2:质粒pCAMHE-EPSPS，泳道3:阴性对照，未转化植物

逆转录-定量聚合酶链反应显示，转基因植物中的EPSPS表达水平明显较高(图5)。Desiree转化体的表达量是对照的许多倍。同样，源自LadyOlympia,AgriaandGranola的转基因的表达量(数据未显示)也显示了4-15倍的表达增加。这些结果证实了转基因植物中EPSPS基因的功能。

图5转基因植物中通过实时聚合酶链式反应测定的EPSPS转录水平相对于内标的系数。为了数据的标准化，广泛使用EF1α，表达水平以相对折叠变化表示

尼日尔奥马尔·哈里斯代米尔大学农业科学与技术学院的AllahBakhsh为该论文的第一作者

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