年12月13日，墨尔本大学JesseT.Beasley等人在PlantJournal杂志在线发表了题为“Multi-yearfieldevaluationofnicotianaminebiofortifiedbreadwheat”的研究论文。前期的研究作者们证明了在Bobwhite中组成型过表达水稻烟碱酰胺合成酶基因OsNAS2可提高小麦全粉和精粉的锌铁含量和生物可利用度，本研究通过三年三点田间种植T5-T7代转基因小麦材料，调查了田间农艺和微量元素营养品质性状，证明了转基因材料精粉中显著提高的铁生物可利用度不影响产量，锌铁生物强化应靶向提高锌铁生物可利用度。
一、背景
微量营养元素缺乏又称“隐性饥饿”，解决途径之一是生物强化，即通过遗传改良提高作物自身营养价值。提高小麦籽粒中锌铁含量对于世界欠发达地区，比如中东、北非、阿富汗和巴基斯坦等主要以小麦为主粮且人群锌铁缺乏问题较为严重的地区非常重要。国际生物强化项目在过去二十年通过利用野生二粒小麦和人工合成六倍体等遗传资源和传统育种释放了综合性状较好且锌含量提高至1.3倍的小麦品种。通过利用引入Gpc-B1基因可提高铁含量至1.2倍，然而该基因对小麦生育期和产量负面影响很大。同时，传统生物强化育种还须考虑一些可降低锌铁生物可利用度的化学物质，比如植酸和多酚，这些物质会阻碍人类肠道对于锌铁的吸收。然而，小麦籽粒中绝大多数（70％-80％）的锌铁都和植酸共存在糊粉层，增加全麦面粉的锌铁含量可能本质上并不能提高其可利用度。而其余20%-30%的锌铁存在于籽粒胚乳，因为这些锌铁与植酸少共存所以提高胚乳中的锌铁更有价值。通过转基因手段可以实现小麦精粉中营养物质的提升，在锌铁生物强化中具有很大潜力。
小麦中锌铁在籽粒中的积累依靠金属螯合物和转运体，锌铁通过韧皮部进入籽粒腹沟后，铁进入糊粉层、锌进入胚和腹沟组织。在糊粉层中铁被VIT转运体家族基因储存在糊粉层液泡中，如果在胚乳特异性表达TaVIT2基因可以将铁从糊粉层转运至胚乳中，进而提高精粉中铁含量至2倍。在韧皮部中绝大多数锌铁等金属与烟碱酰胺（NA）螯合，同时NA是植物根部锌铁螯合剂脱氧麦根酸（DMA）的前体物质。在小麦胚乳或精粉中铁也主要和NA、DMA螯合，作者们前期通过在Bobwhite中组成型过表达水稻OsNAS2基因，提高了小麦精粉中的锌铁含量、NA和DMA含量，同时提高了锌铁生物可利用度。
在本研究中，作者们进一步利用OsNAS2转基因小麦材料通过澳大利亚三年三点的有限制田间试验（confinedfieldtrial，评估转基因植株的一个阶段），综合评估其农艺性状、全粉和精粉的品质性状。
二、结果与讨论
1、田间试验的土壤和环境条件
前期研究中作者们利用ubiquitin1启动子连接水稻OsNAS2基因编码序列（图1），构建OsNAS2组成型表达载体通过基因枪法导入Bobwhite，筛选到低拷贝数双插入转基因材料CE-1，表现出显著提高的锌铁含量而其它植株表型无明显变化。在本研究中，作者们进一步利用CE-1的三个姊妹系CE-1.1，CE-1.2，CE-1.3和无转基因对照材料NS的T5，T6和T7代进行三年连续的田间试验，一个澳大利亚优异小麦品种Mace也被种植，试验地点为澳大利亚Glenthorne、Merredin和Katanning。采用随机区组设计，每年每点每份材料设置3-5个小区重复，小区面积第一、二、三年分别为1.8、8.5和18平方米。所有地点都没有施用锌肥。所有地点的降雨量、气温、土壤中PH、导电率、各种大量元素和微量元素都被测定。基因型和环境的互作效应被分析，其对所有表型的影响均达到显著水平，这与前人的研究一致。所有环境中，Bobwhite和其转基因材料的农艺性状总体差于Mace而全粉、麸皮和精粉的营养品质较优。
图1供试材料在Glenthorne的农艺和营养性状表现
2、转基因材料在多环境下田间农艺表现和微量元素营养品质
三个地点转基因材料的表现存在差异。总体而言，转基因材料和非转基因对照相比，株高、千粒重、粒数、分蘖数、收获指数和产量降低，籽粒总蛋白和硫含量、全麦面粉、麸皮和精粉中的锌铁、NA和DMA含量显著提高（图1，2，3）。P，K，Mg等许多元素含量也有显著变化。在作者们之前的研究中，温室中种植的CE-1植株农艺表现无明显变化，而本研究利用CE-1姊妹系进行田间试验，大多性状与非转基因对照相比均显著不同。转基因材料的株高显著降低，这可能是因为硫腺苷甲硫氨酸（SAM）同时是NA和乙烯的前体，过表达NA合成酶基因可能会影响乙烯和其下游靶物质的含量进而影响株高。CE-1的三个姊妹系之间性状也存在不同，可能是因为体细胞无性系变异造成的。这些结果表明转基因植株的评估须要通过多姊妹系多世代和多点田间试验。
图2供试材料在Katanning的农艺和营养性状表现
图3供试材料在Merredin的农艺和营养性状表现
3、转基因材料在多环境下叶片营养元素含量
为了探究灌浆期锌铁从叶片迁移至籽粒的部分，作者们在开花期去除了种植在温室（土壤PH约为6.0）和Katanning（土壤PH约为4.8）植株的旗叶和叶片（图4）。温室中被去除旗叶的转基因材料锌铁含量与对照相比降低的更多，而在Katanning这种现象则不明显，可能是由于两个环境土壤PH不同造成的。温室中土壤PH较高锌铁较难从土壤中迁移至籽粒，而Katanning较低的土壤PH会促进锌铁从地下部转运至籽粒。与NS相比，成熟的转基因材料旗叶中铁含量较低，可能是由于叶片中NA含量较高促进铁从叶片到籽粒的迁移。此外，由于NA也可以螯合铜锰等金属离子，其变化规律与锌铁一致。
图4温室和Katanning去除分蘖、旗叶或叶片后供试材料的锌铁含量
4、精粉中铁生物可利用度与NA、DMA和产量呈正相关，与锌、铁和蛋白含量负相关
利用Caco-2细胞生物实验测定细胞中铁蛋白与总蛋白的比率进而计算铁的生物利用度，结果表明几乎所有环境下，转基因材料与NS相比铁生物利用度均显著提高（图5）。相关性分析表明铁生物利用度与NA呈显著正相关（图6）。除NA、DMA、钾和铁生物利用度以外的营养品质性状，比如锌、铁、总蛋白含量，与农艺性状包括分蘖数、株高、生物量、粒数和产量等均呈显著负相关。为了进一步探究转基因材料籽粒中各部分的锌铁含量，作者们利用滚筒磨将籽粒磨成8个部分，包括麸皮、麦芯等，结果表明大多籽粒区域锌铁提高，NA和DMA在所有区域中均提高。籽粒外层的植酸可能与NA/DMA在生物可利用度方面有拮抗作用，因为在作者们过去的研究中发现转基因材料全粉的铁生物利用度与对照相比无变化。精粉中铁生物利用度可能独立于锌铁含量，但是与NA和DMA呈显著正相关，NA和DMA可以显著提高生物利用度、介导锌铁被人类细胞吸收利用。本研究首次证明了籽粒锌铁含量与产量呈显著负相关，而NA和DMA含量对产量无影响，说明锌铁生物强化育种可以通过提高NA/DMA含量和生物可利用度而不影响产量来实现。
图5供试材料铁生物可利用度分析
图6基与多环境BLUE值的性状间相关性分析
5、转基因材料在多环境下精粉面包营养品质
制作出来的精粉面包冷却1小时后，将面包屑分离出来冻干磨粉做锌铁、NA和DMA含量测定。结果表明，与NS相比，除了Glenthorne其它环境下转基因材料的精粉面包中锌铁含量、NA和DMA含量均显著提高（图7）。面包外观和加工品质无明显变化，这可能是因为NA和DMA由含硫的SAM合成，面包中硫和总蛋白含量提高进而促进二硫键和谷蛋白大聚体形成，最终提高面团流变学特性和面包加工品质。
图7供试材料精粉面包品质分析
三、结论
1、多年多点田间试验表明过表达水稻OsNAS2基因可显著提高小麦全粉、精粉和精粉面包中的锌铁含量、NA和DMA含量和生物可利用度。
2、籽粒锌、铁和总蛋白含量与产量呈显著负相关，而NA和DMA含量不影响产量。
3、精粉中铁生物可利用度与NA含量呈显著正相关，锌铁生物强化应靶向提高NA进而提高生物可利用度。
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