脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA
产品规格：管/48样
产品简介：
脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbatereductase，DHAR）是植物体内一种重要的抗氧化酶，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化循环中促进抗坏血酸再生的关键酶。DHAR在循环中利用抗坏血酸维持植物体内抗坏血酸的正常代谢水平，保护细胞组分抵御氧化损伤方面发挥着重要作用。DHAR催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原脱氢抗坏血酸（DHA）生成AsA，GSH能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。TNB在波长nm处具有最大光吸收。通过测定GSH的减少速率，计算DHAR活性。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。产品内容：
溶液的配制：
1.试剂二：临用前加入3mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周。2.试剂三：粉剂置于试剂瓶内EP管中。临用前加入3.5mL蒸馏水充分溶解，4℃保存。3.标准品：临用前加入1mL蒸馏水，配制成10mg/mL的标准溶液。需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、冰、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸馏水。操作步骤：
一、样品处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加提取液1mL），冰上充分研磨匀浆，g，4℃，离心10min，取上清液置于冰上待测。2.细菌、细胞：按照细胞数量（个）：提取液体积（mL）为-0：1的比例（建议万细胞加入1mL提取液），冰浴超声破碎细胞（功率w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。3.血清等液体：直接检测。二、测定操作1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到nm，蒸馏水调零。2.标准溶液的配制：将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为0.5、0.25、0.、0.、0.03、0.mg/mL的标准溶液备用。3.加样表三、DHAR活性计算1.标准曲线的绘制：以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。2.DHAR活性的计算：（1）按蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化1μgGSH氧化为1个酶活力单位。DHAR(U/mgprot)=x×V提取÷（V提取×Cpr）×÷T=50x÷Cpr（2）按样本质量计算：酶活定义：每克样本每分钟催化1μgGSH氧化为1个酶活力单位。DHAR(U/g质量)=x×V提取÷W×÷T=50x÷W（3）按细胞数量计算：酶活定义：每个细胞（细菌）每分钟催化1μgGSH氧化为1个酶活力单位。DHAR(U/cell)=x×V提取÷细胞数量（万个）×÷W÷T=50x÷细胞数量（万个）（4）按血清等液体计算：酶活定义：每mL样本每分钟催化1μgGSH氧化为1个酶活力单位。DHAR（U/mL）=x×V样÷V样×÷T=50xV提取：提取液体积，1mL；：单位换算系数，1mg=g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：20min；V样：加入样本体积，0.02mL。