ELISA实验中，标曲不仅能够帮助我们计算出样本浓度，还是指示实验人员操作手法是否规范的重要标志。
标准曲线的制作，可参考往期文章ELISA实验指南：实验方案设计、初始数据判读及实验结果计算用户
如何判断我绘制的标准曲线是否有效呢？
在显色阶段，控制标准品前4孔有明显的蓝色梯度，以及标准品最大OD值≥1.2，标准曲线的线性回归相关系数R2≥0.99，即可作为有效标曲。
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但是，在ELISA实验过程中，往往有标曲异常的情况出现，下面，将介绍几种特殊情况，并将其原因与对策一一道来。
例1：整体偏低
虽然标曲有一定梯度，但是最大OD值1.2，梯度没有拉开。
可能原因：
1)试剂盒过期或保存不当；
2)标准品未溶解完全；
3)加入终止液后，没有立即检测；
4)试剂盒部分试剂（特别是洗涤液）混用其他批次，或为混用外源溶剂。
建议：
1)按照说明书保存各组分，在保质期内使用；
2)标准品溶解前，需要离心处理(×g离心1分钟)，加入1.0mL标准品样品稀释液后，静置1-2分钟，用低速涡旋仪充分混匀；
3)加入终止液后，请立即进行检测。若需等待，放置在避光处的时间不宜超过10分钟；
4)使用试剂盒内一套完整的试剂，不要混用其他批次或外源溶剂。
例2.无信号
标曲没有显色，OD值无梯度变化。
可能原因：
1)试剂盒过期，或保存不当；
2)HRP酶受到污染，导致活力和效价降低；
3)实验操作失误。例如：将生物素化抗体工作液和酶结合工作液的加样顺序颠倒；
4)订购多个指标，实验时混用标准品、酶标板、生物素化抗体等。
建议：
为了快速排查原因，请尝试混合10μL底物溶液和2μL浓缩HRP酶，观察是否发生颜色变化，并及时对显色结果拍照。
如果有颜色变化（混用后呈现深蓝色/蓝绿色），表明HRP酶和TMB并无污染问题，可重新取一条板条，在避免以上问题的情况下制作标曲。
例3：整体偏高
酶标仪仪器光密度范围过广，导致检测OD值范围也很高。建议光密度范围设置在0-3.5之间。
可能原因：
部分OD值超出仪器检测范围，可能是由于工作液浓度过高，或孵育时间过长/温度过高。
建议：
1)按照说明书要求，在工作液使用前15分钟，将浓缩液于×g离心1分钟，以浓缩液：稀释液=1：99的比例，现配现用；
2)孵育箱或烘箱需控制温度恒定37℃，温差不超过1℃，底物反应时间为15分钟左右。建议根据标准孔前4孔出现明显蓝色梯度，来控制实际显色时间，显色时间酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。
例4：全阳性
可能原因：
1)竞争法按照夹心法操作；
2)洗涤不当：洗涤时每孔注入的洗液不够，或洗涤次数不够；液体过多溢出污染；浸泡时间过短；
3)显色剂保存不当，孵育时未避光，或试剂被污染等，造成非特异性显色。
建议：
1)夹心法和竞争法原理不同，操作步骤不同，请注意区分；
2)按照说明书中洗涤操作进行洗涤；
3)避光保存底物溶液，使用前再拿出，避光孵育；各类试剂现用现拿，现配现用，注意枪头和加样槽的洁净，避免试剂污染。
以上是本篇文章分享给大家的常见ELISA标曲异常的原因及对策。大家是不是还没有看够？下期我们将继续分享相关内容，请继续