羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒（微量法）
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液nm吸光值，可计算HYP含量。
产品内容：
提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）=1:1，室温保存。
试剂一：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
标准品：液体0.5mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。
需自备的仪器和用品：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L盐酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、羟脯氨酸提取：
1、组织：称取约0.2g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL的提取液，煮沸或℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/LNaOH（约1mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质）
2、细胞：取万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或℃烘箱2至6小时消化至透明状，rpm，25℃，离心20min，用10mol/LNaOH（约0.5mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至2mL，取上清待测。
二、测定步骤：
1、将标准品稀释为30、15、7.5、3.75、1.、0.、0.、0.g/mL的标准溶液。
2、分光光度计预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
3、按下表进行操作：
三、羟脯氨酸含量计算公式
1、标准曲线的绘制：
以标准溶液的浓度为x轴，A标准（A=A标准管-A空白管）为y轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将A测定（A=A测定管-A空白管）带入方程得到x。
2、羟脯氨酸含量的测定：
（1）按样本鲜重计算：
组织羟脯氨酸含量（g/g鲜重）=x×V样品÷（W×V样品÷V组提）=4x÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
组织羟脯氨酸含量（g/mgprot）=x×V样品÷（Cpr×V样品）=x÷Cpr
（3）按细菌或细胞数量计算：
细胞羟脯氨酸含量（g/cell）=x×V样品÷（细胞数量×V样品÷V胞提）=2x÷细胞数量
V样品：加入的样品体积，0.06mL；V组提：组织提取液体积，4mL；V胞提：细胞提取液体积，2mL；W：样本鲜重，g；细胞数量：以为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、OD值大于1.0，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。