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言
香港中文大学医学院于君教授课题组在Gut期刊发表的题为“Dietarycholesteroldrivesfattyliver-associatedlivercancerbymodulatinggutmicrobiotaandmetabolites”的研究成果，通过粪便微生物16SrRNA测序和血清LC-MS代谢组研究方法，发现了胆固醇调节的微生物群在NAFLD-HCC中的直接作用，并发现阿托伐他汀恢复了胆固醇诱导的肠道菌群失调并完全阻止了NAFLD-HCC的发展。确认了膳食胆固醇通过诱导小鼠肠道微生物群和代谢物的改变来驱动NAFLD-HCC的形成。胆固醇抑制治疗和肠道菌群操作可能是预防NAFLD-HCC的有效策略，为治疗NAFLD-HCC提供了理论依据。
中文标题：膳食胆固醇通过调节肠道微生物群和代谢物来驱动脂肪肝相关的肝癌
研究对象：小鼠
发表期刊：Gut
影响因子：23.
发表时间：年7月
研究单位：香港新界香港中文大学消化疾病研究所及内科及药物治疗学系
运用生物技术：血清代谢组分析、微生物16SrRNA测序
研究背景
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征的肝脏表现，包括从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的一系列肝脏病变。NASH可进展为肝硬化、终末期肝功能衰竭和肝细胞癌(HCC)。在肝脏脂质种类中，胆固醇被认为是NASH发展中的主要脂毒性分子。肝脏是调节全身胆固醇稳态的中心。在NASH的人类和实验模型中都证实了肝脏胆固醇稳态的异常。我们发现角鲨烯环氧酶是胆固醇生物合成中的一种限速酶，可促进NAFLD-HCC的发展。膳食胆固醇对血浆和肝脏胆固醇稳态具有重要影响。长期胆固醇治疗对自发性和进行性NAFLD-HCC发展的作用和发病机制尚不清楚。
肠道微生物群与其宿主具有共生关系，并通过在大肠中代谢包括胆固醇在内的膳食成分来提供营养和能量。研究表明，肠道微生物组是导致NAFLD发展及其进展为NAFLD-HCC的环境因素。然而，肠道菌群失调是否是膳食胆固醇诱导的NASH和NAFLD-HCC进展的原因或影响仍不清楚。
本研究确定膳食胆固醇在NAFLD-HCC发展中的作用和相关分子机制。我们发现膳食胆固醇通过胆固醇诱导的肠道微生物群变化和代谢组学改变导致自发的NAFLD-HCC形成。胆固醇抑制恢复了肠道微生物群并完全阻止了NAFLD-HCC的发展。
研究思路
研究结果
膳食胆固醇自发驱动NAFLD-HCC的发展
为了检查膳食胆固醇在脂肪变性、NASH、纤维化和NAFLD-HCC演变中的作用，给小鼠喂食HFHC、HFLC或NC。在不同时间点（3、8、10、12和14个月）监测血清甲胎蛋白（AFP，肝癌标志物）水平。与喂食HFHC的小鼠相比，在第10个月观察到AFP水平升高（.1±.9ng/mL），在第12个月（.6±.3ng/mL）和第14个月（.2±.1ng/mL）进一步升高在第14个月使用HFLC（HFLC中为50.9±7.5ng/mL）或NC（59.7±20.9ng/mL）（图1A）。MRI扫描显示HFHC喂养的小鼠在第14个月时出现肝肿瘤，但在HFLC喂养或NC喂养的小鼠中没有发现（图1B）。然后在第14个月收获小鼠。在68%(13/19)喂食HFHC的小鼠中发现肝肿瘤，但在喂食HFLC或NC饮食的小鼠中没有发现肝肿瘤（图1C）。肝脏切片的组织学检查证实所有肝脏肿瘤均为HCC（图1C），每只小鼠平均有2.7±2.6个HCC，最大肿瘤直径为4.1±5.0mm。与HFHC喂养的小鼠相比，HFHC喂养小鼠的肝脏切片中Ki-67阳性细胞明显增多，表明HFHC喂养小鼠的细胞增殖增加（图1C）。这些结果表明，膳食胆固醇可以自发诱导NAFLD-HCC的形成。
随着HCC的形成，与NC喂养的小鼠相比，HFHC喂养的小鼠在第14个月时体重、内脏脂肪、肝脏重量和肝体重比显着增加（图1D）。喂食HFLC的小鼠体重、内脏脂肪和肝脏重量也有所增加（图1D）。与HFLC喂养或NC喂养的小鼠相比，HFHC喂养的小鼠的血清胆固醇、肝脏游离胆固醇和胆固醇酯、葡萄糖耐受不良和空腹胰岛素显着增加（图1E）。与NC相比，在喂食HFLC的小鼠中也观察到增强的葡萄糖耐受不良和空腹胰岛素（图1E）。
图1
胆固醇在C57BL/6小鼠中诱导自发HCC形成
a)喂食HFHC饮食3、8、10、12和14个月的小鼠以及喂食NC或HFLC饮食14个月的小鼠的血清AFP水平；
b)肝脏MRI,
c)喂食NC、HFLC和HFHC14个月的小鼠肝脏中Ki67染色的代表性大体形态、代表性显微特征和免疫组织化学图片,Ki-67根据以下标准评分:0(10%细胞染色）、1（11%–30%细胞染色）、2（30%–50%细胞染色）或3（50%细胞染色）
d)喂食NC、HFLC的小鼠的体重、内脏脂肪、肝脏重量、肝脏重量比、
e)血清胆固醇水平、肝脏游离胆固醇、肝脏胆固醇酯含量、葡萄糖耐量试验和空腹胰岛素水平和HFHC14个月。
喂食高胆固醇饮食14个月的小鼠出现NASH和纤维化
肝脏切片的进一步检查显示，在HFHC喂养14个月的小鼠的HCC邻近肝组织和非HCC肝组织中存在以脂肪变性和小叶炎症为特征的脂肪性肝炎，而在HFLC喂养的小鼠中仅观察到脂肪变性（图2A）。与组织学炎症一致，与喂食HFLC或NC的小鼠相比，喂食HFHC的小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)(p0.01)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)(p0.01)水平显着增加（图2B）。血清和肝脏促炎细胞因子包括IL-6、IL-1α和IL-1β（图2C、D）在HFHC喂养的小鼠中增加。RNA测序表明，与HFLC喂养的小鼠相比，14个月HFHC喂养小鼠的肝组织中关键的NASH相关促炎细胞因子，包括Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16和Tnfα，显着上调（图2D）。
HFHC喂养的小鼠表现出严重的纤维化损伤，胶原分布区域显着增加（图2E），通过肝羟脯氨酸测定法测定的胶原含量（图2F）和肝星状细胞活化，如增加的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白质水平（图2E）。对肝脏氧化应激的检查显示，在HFHC喂养的小鼠中，氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与NADH（NAD的还原形式）的比率和抗氧化超氧化物歧化酶(SOD)活性显着降低（图2G），表明肝脏氧化饮食胆固醇的压力。总的来说，这些发现表明NASH和纤维化是在HFHC喂养小鼠的非HCC肝组织中形成的。
图2
胆固醇在喂食HFHC饮食的小鼠的非HCC肝组织中引起NASH和纤维化。
a)具有代表性的HE染色、肝切片的组织学评分；
b)血清ALT和AST水平；
c)用NC、HFLC和HFHC喂养14个月的小鼠通过细胞因子分析测定的血清IL-6、IL-1α和IL-1β蛋白水平；
d)用HFLC和HFHC喂养的小鼠的RNA测序通过ELISA和Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16、TnfαmRNA水平测定肝脏促炎细胞因子IL-6、IL-1α和IL-1β蛋白水平14个月；
e)天狼星红染色的胶原沉积，免疫组织化学染色和RT-PCR的α-SMA蛋白和mRNA水平
f)肝脏羟脯氨酸含量
g)用NC、HFLC和HFHC喂养14个月的小鼠的肝脏NAD+与NADH比率和SOD活性。
高胆固醇饮食在小鼠中依次导致脂肪肝、脂肪性肝炎和纤维化
为了阐明饮食胆固醇在HCC形成之前NAFLD的进展，我们监测了喂食HFHC的小鼠的血清ALT、AST、胆固醇、AFP和肝脏组织学变化。在饮食喂养后3、8、10和12个月收获小鼠（图3A）。我们观察到在3个月和8个月时，与喂食HFLC的小鼠相比，喂食HFHC的小鼠的体重和内脏脂肪重量增加，同时肝脏重量和肝体重比增加。血清ALT和AST的增加与HFHC喂养的小鼠血清胆固醇水平升高一致。HFHC喂养小鼠的肝脏组织学显示，3个月时有轻度炎症的脂肪变性，8个月时伴有纤维化的脂肪性肝炎，10、12和14个月时有HCC形成，而HFLC喂养的小鼠在3、8个月时仅显示脂肪变性而没有进一步的HCC发展。10个月和14个月（图3B）。我们还对两种HCC标志物AFP和高尔基蛋白73(GP73)进行了免疫组化。
在HFHC喂养小鼠的肝组织上观察到阳性染色，但在HFLC喂养的小鼠身上没有观察到阳性染色。肝脏脂肪变性、小叶炎症和肝胶原区域的评分证实了整个疾病阶段肝脏组织学的严重程度增加（图3B）。此外，10%(1/10)的HFHC喂养小鼠在10个月时发展为HCC（肿瘤数=0.1±0.32，最大肿瘤直径=0.55±1.74mm），25%(3/12)在12个月时发展为HCC（肿瘤数=0.25±0.45，最大肿瘤直径=1.57±3.10mm)和68%(13/19)在14个月时发展为HCC（图3C），表明HFHC喂养的小鼠逐渐发展为脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化和NAFLD–肝癌。
图3
喂食HFHC的小鼠依次发展为脂肪肝、脂肪性肝炎、纤维化和HCC
a)用HFHC饮食治疗C57BL/6小鼠的示意图。在3、8、10和12个月大时处死小鼠。
b)喂食HFLC14个月和喂食HFHC3、8、10、12和14个月的小鼠肝脏中肿瘤标志物AFP和GP73的代表性大体形态、HE染色和IHC染色；计算脂肪变性和炎症的组织学评分以及天狼星红染色的定量。
c)不同时间点喂食HFHC的小鼠的最大肿瘤的肿瘤发病率、肿瘤数量和最大肿瘤直径。
在NAFLD-HCC的发生和发展过程中，膳食胆固醇诱导的肠道菌群失调
为了探索肠道微生物群在介导膳食胆固醇诱导的NAFLD-HCC中的潜在作用，我们对14个月时喂食HFLC和喂食HFHC的小鼠的粪便进行了16SrRNA基因测序。分析表明，观察到的操作分类单元(OTU)数量达到饱和。通过主成分分析(PCA)在14个月时，在喂食HFLC和喂食HFHC的小鼠之间观察到肠道微生物群组成分离(p0.)(图4A)。此外，与HFLC饮食喂养的小鼠相比，在14个月时，在HFHC喂养的HCC小鼠中观察到较低的细菌多样性和增加的细菌丰富度（图4A）。通过差异丰度分析确定胆固醇相关的细菌类群。与喂食HFLC的小鼠相比，喂食HFHC的小鼠中几种细菌OTU的丰度存在差异（图4B）。主成分和冗余分析还显示，喂食HFHC3个月（伴有轻度炎症的简单脂肪变性）、8个月（伴有纤维化的脂肪性肝炎）和14个月（HCC）的小鼠的微生物群组成明显聚集（图4C），表明在NAFLD-HCC进展阶段的肠道微生物群。此外，随着NAFLD-HCC的进展，细菌丰富度依次增加（图4D）。特别是，观察到Mucispirillumschaedleri_Otu、Desulfovibrio_Otu、Anaerotruncus_Otu和Desulfovibrionaceae_Otu从3个月到8个月和14个月的HFHC喂养依次增加（图4D）。此外，除其他外，我们观察到的富集梭菌个OTU如梭菌celatum_Otu，C.ruminantium_Otu，C.cocelatum_Otu和C.methylpentosum_Otu，以及耗尽Bifidobacterium_Otu，Akkermansiamuniciphila_Otu，Lactobacillus_Otu，拟杆菌acidifaciens_Otu，Bacteroides_Otu，B.uniformis_Otu和乙.egerthii_Otu与高膳食胆固醇。此外，与HFHC喂养的无肿瘤小鼠相比，富含HFHC的甘曼尼螺杆菌_Otu在有肿瘤的HFHC喂养的小鼠中更丰富，而在有肿瘤的HFHC喂养的小鼠中，与没有肿瘤的HFHC喂养的小鼠相比，HFHC耗尽的拟杆菌属_Otu减少。这些表明，甘曼螺杆菌_Otu的进一步富集和拟杆菌属_Otu的消耗可能对肠道菌群在NAFLD-HCC中的作用很重要。此外，与HFLC喂养的小鼠相比，HFHC喂养的小鼠肠道微生物群相关的色氨酸代谢能力降低（图4）。这些综合起来表明，高胆固醇饮食会导致肠道菌群失调和微生物色氨酸代谢受损。
对细菌丰度与小鼠表型的潜在关联相关性分析。我们观察到M.schaedleri_Otu,Desulfovibrio_Otu,Anaerotruncus_Otu,C.celatum_Otu,C.cocelatum_Otu和C.methylpentosum_Otu在HFHC喂养小鼠的粪便样本中富集呈正相关（图4F），而Bifidobacterium_Otu,B.acidifac、A.municiphila_Otu和Lactobacillus_Otu在HFHC喂养的小鼠中被耗尽，与高胆固醇饮食、血清和肝脏胆固醇水平呈负相关（图4F）。这些结果表明NAFLD-HCC中的肠道菌群失调与胆固醇水平相关。
为了证实我们在人类患者动物实验中的发现，我们分析了59例高胆固醇血症患者和39名健康受试者的血清胆固醇和肠道微生物群的相关性。双歧杆菌和拟杆菌与血清总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇呈负相关，但与高密度脂蛋白(HDL)-胆固醇呈正相关（图4G）。这些结果与喂食HFHC的小鼠的观察结果一致，进一步推断肠道微生物群参与了胆固醇诱导的疾病。
图4
膳食胆固醇诱导的肠道菌群失调。
a)14个月HFLC和HFHC喂养的小鼠之间的主成分排序分析(PcoA)、香农多样性和肠道微生物群的丰富度。
b)喂食HFLC或HFHC14个月的小鼠粪便中细菌的热图。
c)分别喂食3个月、8个月和14个月的HFHC后肠道菌群的PCoA和冗余分析。
d)通过chao1指数测量的微生物群丰富度，并在HFHC喂养的3、8至14个月内依次增加细菌。
e)HFLC喂养和HFHC喂养小鼠的肠道微生物群色氨酸代谢能力。
f)细菌丰度与小鼠表型的相关性。
g)宏基因组测序与血清总胆固醇、甘油三酯、59例高胆固醇血症人类病例和39名健康受试者中的LDL-胆固醇和HDL胆固醇。
膳食胆固醇通过诱导代谢物改变促进NASH-HCC进展
为了揭示可能与胆固醇诱导的NAFLD-HCC相关的与肠道微生物组相关的代谢表型，我们对喂食HFHC和喂食HFLC的小鼠的血清进行了代谢组学分析。根据PCA测定的膳食胆固醇含量，血清代谢物存在显着差异（图5A）。胆汁酸生物合成是喂食高胆固醇饮食的小鼠中改变的关键途径（图5B）。在HFHC喂养的小鼠中，包括牛磺胆酸(TCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、甘氨胆酸(GCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)在内的初级胆汁酸是异常上调的代谢物（图5C）。另一方面，作为微生物色氨酸代谢产物的3-吲哚丙酸(IPA)在HFHC喂养的小鼠中是异常下调的代谢物（图5C）。此外，与HFLC喂养的小鼠相比，HFHC喂养的小鼠门静脉中血清脂多糖(LPS)浓度升高，结肠E-钙粘蛋白丢失（图5D），这表明膳食胆固醇会损害肠道屏障功能。进行相关性分析以确定HFHC改变的微生物和代谢物的潜在关联。一致地，相关性分析表明，富含HFHC的Mucispirillumschaedleri_Otu与TUDCA、TCDCA、TCA和GCA呈正相关。富含HFHCRoseburia_Otu和Helicobacter_ganmanii_Otu也与TUDCA和TCDCA呈正相关。此外，HFHC耗尽的Akkermancia_muciniphila_Otu与TCDCA和TUDCA呈负相关，而HFHC富集的Anaerotruncus_Otu与IPA呈负相关（图5E）。
进一步的实验表明，高膳食胆固醇不能改变胆汁酸合成酶的mRNA表达，包括肝脏中的细胞色素P(Cyp)7a1、Cyp8b1、Cyp27a1和Cyp7b1（图5F）。额外的体外实验表明，TCA在人类正常永生化肝细胞系LO2中加重了胆固醇诱导的甘油三酯积累（图5G），而IPA抑制了NASH中胆固醇诱导的脂质积累（图5G）和细胞增殖（图5H）–HCC细胞系，HKCI-2和HKCI-10。这些结果表明，胆固醇通过调节宿主血清代谢物以及至少部分通过增加TCA和减少IPA来促进NASH-HCC进展。
图5
膳食胆固醇诱导的小鼠血清代谢谱的改变。
a)通过主成分排序分析，喂食HFLC和HFHC饮食的小鼠的血清代谢物显着不同。
b)喂食HFHC饮食的小鼠中差异富集的代谢物的途径分析。
c)喂食HFLC和HFHC饮食的小鼠血清代谢组学火山图，显示了代谢物的异常值。
d)喂食HFLC和HFHC饮食3个月的小鼠门静脉血液中的LPS浓度和喂食14个月HFLC和HFHC饮食的小鼠结肠组织中E-钙粘蛋白的表达。
e)HFHC改变的微生物和代谢物关联的相关性分析。
f)喂食HFLC和HFHC饮食的小鼠肝组织中Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1和Cyp7b1的mRNA水平。
g)通过油红O染色，TCA加重了胆固醇诱导的人LO2细胞系中的甘油三酯积累，而IPA抑制了NASH-HCC细胞系、HKCI-2和HKCI-10中胆固醇诱导的甘油三酯积累。胆固醇，μg/mL；
h)IPA抑制NASH-HCC细胞系中的细胞增殖。
高胆固醇调节的肠道微生物群促进无菌小鼠的脂肪性肝炎和肝细胞增殖
我们通过粪便微生物群移植（FMT）评估了胆固醇调节的微生物群在NAFLD-HCC中的贡献。在NC饮食下，将NC喂养、HFLC喂养和HFHC喂养的小鼠（14个月）的粪便灌胃给无菌小鼠（G-NC、G-HFLC和G-HFHC）（图6A）。与G-NC小鼠相比，G-HFHC小鼠的肝体重比显着更高。此外，甘油三酯测定和油红O染色（图6B）的肝脏脂质积累和硫代巴比妥酸反应物质测定（图6B）的过氧化显着增加，同时H＆E染色的肝脏组织学受损（图6B）在FMT后8、10和14个月的G-HFHC小鼠中。通过细胞因子分析测定增强的肝细胞因子和趋化因子包括IL-6（图6C），通过cDNA表达测定，Fos、Ccl12、Cxcr1、Ccl1、Myd88、Il-1β、Cxcl10和C3ar1。证明炎症增加与G-HFLC小鼠相比，通过流式细胞术在G-HFHC小鼠中增强CD45+淋巴细胞积累。
在14个月时，在G-HFHC小鼠的肝脏中观察到肝细胞增殖增加（p0.05）（图6D），但在FMT后8个月和10个月则没有。癌症通路PCR阵列显示肝组织中涉及致癌通路的基因上调，包括细胞增殖(Cdc20)、血管生成(Pgf)、侵袭/转移(Serpinb2、Snai3)和参与细胞凋亡的基因(Fasl和Lpl)下调-HFHC小鼠与G-NC和G-HFLC小鼠相比（图6E1）。通过蛋白质印迹验证CDC20的上调（图6E2）。G-HFHC小鼠在14个月时观察到一个肝结节，但在8和10个月时未观察到（图6A）。组织学检查证实结节为具有小球和细胞增殖增加的不典型增生（图6A）。我们评估了受体无菌小鼠及其相应的供体常规小鼠肠道微生物群的组成。我们发现，与供体饮食相关的受体无菌小鼠的肠道微生物群存在显着差异（图6F）。如β多样性和组成分析所示，FMT后的微生物生态系统在所有小鼠组中随时间保持稳定。此外，无菌小鼠血清代谢物分析显示，与喂食HFHC的常规小鼠相比，G-HFHC小鼠的IPA降低（图6G）。总之，这些数据表明膳食胆固醇调节的微生物群通过诱导代谢物改变来促进NAFLD和肝细胞增殖，从而促进胆固醇诱导的NAFLD-HCC形成。
图6
高胆固醇调节的微生物群促进无菌小鼠模型中的肝细胞增殖
a)粪便从NC喂养、HFLC喂养和HFHC喂养的小鼠（14个月）移植到NC下的无菌小鼠（G-NC、G-HFLC和G-HFHC）。显示了G-NC、G-HFLC或GHFHC组灌胃无菌小鼠肝脏的大体形态、组织学检查和Ki-67染色。
b)G-NC、G-HFLC或G-HFHC组的受体无菌小鼠在8、10和14个月时的肝脏甘油三酯含量、脂质过氧化和肝脏组织学。
c)G-NC、G-HFLC或G-HFHC组在14个月时的肝脏IL-6蛋白水平和
d)Ki-67染色。(E1)G-NC、G-HFLC或G-HFHC小鼠肝组织中的小鼠癌症通路FinderPCR阵列。
e)CDC20蛋白水平得到验证。
f)G-NC、G-HFLC或G-HFHC小鼠肠道菌群线性判别分析(LDA)得分的主成分排序分析和直方图。
g)G-HFLC和G-HFHC小鼠的血清代谢组学分析。
抗胆固醇治疗完全防止HFHC喂养小鼠的NAFLD-HCC形成
由于膳食胆固醇驱动NAFLD-HCC的进展，我们评估了抗胆固醇药物是否可以抑制NAFLD及其进展为HCC。阿托伐他汀(20mg/kg)是一种降胆固醇药物，对已喂食HFHC7个月的小鼠给药，并继续喂食HFHC和阿托伐他汀7个月（图7A）。在实验结束时（14个月），阿托伐他汀完全阻止了HFHC饮食诱导的NAFLD-HCC形成，并改善了NASH的严重程度（图7B）。这伴随着血清胆固醇、肝游离胆固醇、血清AFP显着降低（图7C）、ALT、降低血清促炎细胞因子（IL-6、IL-1α、IL-1β、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β）和氧化应激（增加NAD+与NADH的比率和SOD活性）（图7D)。阿托伐他汀还通过显着减少肝胶原沉积和羟脯氨酸含量来改善肝纤维化（图7E）。通过16SrRNA基因测序对在阿托伐他汀治疗(HFHC+At)下喂食HFHC的小鼠的粪便进行微生物群分析，并与喂食NC、HFLC和HFHC的小鼠进行比较。抗胆固醇阿托伐他汀治疗显着恢复了喂食HFHC的小鼠的细菌丰富度（图7F）。
此外，在HFHC喂养小鼠的失调OTU中（图4B和D)，发现Mucispirillumschaedleri_Otu、Desulfovibrio_Otu、Anaerotruncus_Otu和Desulfovibrionaceae_Otu的丰度被抗胆固醇处理逆转（图7F）。为了研究微生物群在抗胆固醇药物预防的NAFLD-HCC中的直接作用，我们将HFHC+At小鼠的粪便灌胃给无菌小鼠（G-HFHCat，n=10）。与G-HFHC组相比，G-HFHCat小鼠在灌胃后14个月表现出肝脏组织学改善，肝脏甘油三酯和脂质过氧化降低（图7G）。在用阿托伐他汀治疗的HFHC小鼠中观察到IPA的诱导和TCA的减少。这些结果进一步表明，肠道微生物群在介导胆固醇诱导的NAFLD-HCC中发挥着积极作用。
图7
胆固醇抑制消除了HFHC喂养小鼠的NAFLD-HCC进展
a)喂食HFHC饮食的C57BL/6小鼠的阿托伐他汀治疗示意图。
b)用或不用阿托伐他汀治疗的HE染色HFHC喂养的小鼠肝脏的代表性总体形态和显微特征，计算脂肪变性、炎症和胶原蛋白的组织学评分。
c)血清胆固醇水平、肝脏游离胆固醇水平、血清AFP水平
d)血清ALT水平、肝脏NAD+与NADH比率、肝脏SOD活性、血清IL-6、IL-1α、IL-1β、MCP-1、在接受或不接受阿托伐他汀治疗的HFHC喂养小鼠中，MIP-1α、MCP-1β蛋白水平、
e)胶原沉积和羟脯氨酸含量。
f)用或不用阿托伐他汀治疗的NC、HFLC和HFHC喂养的小鼠粪便中细菌的细菌丰富度和热图图。
g)HFHCat粪便灌胃无菌小鼠(G-HFHCat)中肝脏的大体形态、组织学检查、甘油三酯和脂质过氧化
h)胆固醇诱导的NAFLD-HCC发展机制示意图
研究讨论
尽管胆固醇在NASH中是一种已知的细胞毒性脂质，关于胆固醇在NASH引起的HCC发展中的作用和重要机制的信息是有限的。在这项研究中，我们首次证明长期高膳食胆固醇喂养会导致小鼠自发性NAFLD-HCC发展。我们研究了高膳食胆固醇从NAFLD发展为HCC的主要机制。我们发现喂食高胆固醇饮食的小鼠在NAFLD-HCC中ROS积累增加。积累的ROS是一种有毒介质，可诱导炎症反应、胰岛素抵抗和氧化损伤。事实上，我们的分析表明，膳食胆固醇会诱导ROS和促炎细胞因子，从而促进NASH和HCC的发展。我们的研究结果为肠道菌群失调在胆固醇诱导的NAFLD-HCC进展中的潜在作用提供了新的见解。除了肠道菌群失调外，共生细菌产生的小分子代谢物也可能导致NAFLD的发病。我们的研究结果表明，胆固醇可能会损害胆汁酸代谢和微生物色氨酸代谢，导致血清TCA升高，IPA降低，从而促进NAFLD-HCC的发展。阿托伐他汀治疗的HFHC喂养小鼠的粪便不会促进受体无菌小鼠的肝细胞增殖。这些观察结果进一步强调了阿托伐他汀在预防胆固醇诱导的NAFLD-HCC发展中的潜在用途。
小鹿推荐
这项研究首次表明，长期高膳食胆固醇通过调节肠道微生物群诱导雄性小鼠自发和进行性发展为NAFLD-HCC。胆固醇通过肠道菌群改变诱导TCA增加和IPA减少，从而促进肝脏中的脂质积累和细胞增殖，导致NAFLD-HCC发展。抗胆固醇治疗完全消除了膳食胆固醇诱导的NAFLD-HCC形成。这项研究强调了胆固醇抑制和对肠道微生物群及其相关代谢物的控制可能是预防NAFLD-HCC的有效策略。
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