异柠檬酸裂解酶（ICL）检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。
ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在nm下有特征吸收峰，监测nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
试验中所需的仪器和试剂:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
产品组成：
溶液的配制：
1.提取液：临用前将试剂七加入到提取液中，勿放于-20℃；
2.试剂三：临用前每瓶加入5mL双蒸水，充分混匀待用；用不完的试剂可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
3.试剂四：临用前每瓶加入5mL双蒸水，充分混匀待用；用不完的试剂可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
4.试剂五：液体置于试剂瓶内EP管中。根据用量按照试剂五:蒸馏水为1:8的体积比例充分混匀，现用现配；
5.试剂六：临用前每瓶加入5mL双蒸水，充分混匀待用；用不完的试剂4℃保存；
6.工作液配制：按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=29:35:42:42:3的比例将各试剂混合后备用，根据样本数量现用现配。
操作步骤(仅供参考)：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1.细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次），10g，4℃，离心20分钟，取上清，置冰上待测。
2.组织处理：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；10g，4℃，离心20分钟，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1.紫外分光光度计预30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2.样本测定
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96孔UV板中，加试剂六的同时开始计时，在nm波长下记录10秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟（如果酶标仪有控温功能可以将温度设置为37℃或25℃）；迅速取出比色皿并擦干，nm下比色，记录2分10秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
三、ICL活性计算
A．用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.组织中ICL活力的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(V样本×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/g质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(W÷V提取×V样本)÷T=×ΔA÷W
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：1mL石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；：单位换算系数，1mol=nmol。
2.细菌或培养细胞中ICL活力的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(V样本×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
（2）按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(÷V提取×V样本)÷T=4.59×ΔA
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：1mL石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；：细菌或细胞数量，万；T：反应时间，2min；：单位换算系数，1mol=nmol。
B.用96孔板测定的计算公式如下
1.组织中ICL活力的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(V样本×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/g质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(W÷V提取×V样本)÷T=×ΔA÷W
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；：单位换算系数，1mol=nmol。
2.细菌或培养细胞中ICL活力的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(V样本×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
（2）按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×÷(÷V提取×V样本)÷T=7.65×ΔA
V反总：反应总体积，0.2×10-3L；V样本：加入样本体积，0.mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.6cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；：细菌或细胞数量，万；T：反应时间，2min；：单位换算系数，1mol=nmol。
注意事项：
1.测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。