ATP-磷酸果糖激酶（ATP-PFK）是糖酵解的关键酶，作用于糖酵解途径的第一步反应，催化果糖-6-磷酸形成果糖-1，6-二磷酸。这个反应阻止了果糖-6-磷酸用于合成蔗糖和淀粉的过程，起着控制整个糖酵解过程的作用。ATP-PFK受到一些代谢产物如ATP，磷酸烯醇式丙酮酸和柠檬酸的抑制。Pi，Mg2+、Na+和K+等离子促进该酶的活性。当细胞中ATP，PEP和柠檬酸水平较高时，ATP-PFK活性受到抑制，糖酵解途径速度下降，避免糖酵解产物过剩。相反，当细胞中ATP、PEP和柠檬酸减少而Pi水平增加时，促进ATP-PFK活性提高，使糖酵解速度加快。有实验表明ADP和AMP对该酶有一定的抑制作用，这种抑制作用目前难以解释。
在植物体中，果糖-6-磷酸转化为果糖-1，6-二磷酸的另一途径是由焦磷酸-磷酸果糖激酶（PPi-PFK）催化的。该酶同样是糖酵解的关键酶，植物体内的果糖-2，6-二磷酸是PPi-PFK的活化剂。果糖-2，6-二磷酸还抑制果糖-1，6-二磷酸酯酶的活性，该酶催化果糖-1，6-二磷酸水解成果糖-6-磷酸。这种抑制作用有利于果糖-1，6-二磷酸的形成和糖酵解的进行。糖酵解的这些调节关系可以用图2—10来表示。如果糖酵解占优势，则蔗糖的形成受到抑制，因为这两个过程竞争共同底物果糖-6-磷酸。这种竞争可能是决定蔗糖是用于呼吸还是运往植物其他部分的控制机制。这种竞争依赖于果糖-2，6-二磷酸的迅速变化水平。细胞质中果糖-2，6-二磷酸通常含量在1～10μmol/L之间。
糖酵解途径中的丙酮酸激酶，长期被认为是糖酵解的关键酶。该酶催化PEP转化成丙酮酸。ATP，柠檬酸抑制该酶活性，而ADP促进其活性。此外，Ca2+抑制丙酮酸激酶活性，而K+和Mg2+则为该酶的活化剂。
除了上述关键酶之外，细胞中NAD+/NADH比值也是糖酵解的重要调节因子。NAD+是糖酵解的重要底物，而NADH为糖酵解的产物。由于O2在NADH氧化产生NAD+中的重要作用，因而植物组织在有氧条件下，细胞质中NADH缺乏，有利于糖酵解的进行。NAD+/NADH比值的调节常常归结为氧浓度的调节。这种氧抑制酒精发酵的现象叫巴斯德效应（Pasteureffect）。