南非威特沃特斯兰德大学和德国弗莱堡大学医学中心的研究人员在科学杂志《Viruses》上，发表了一项和HBV治愈有关的最新进展，这项研究进展旨在说明结合切割病毒DNA的转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）提供一种新方法。
乙肝工程核酸酶研发前景，技术改良后，可以提高小鼠特异性
研究人员认为，持续的乙肝病毒感染依然是全球性医疗问题，估计全球有2.57亿乙肝病毒携带者。可以使用预防性疫苗、免疫调节剂、核苷酸和核苷类似物等形式进行预防和治疗干预。然而，接种预防性疫苗对于慢性乙肝患者没有益处，并且对感染率的影响有限。尽管免疫调节剂和核苷类似物，已获准用于治疗慢性HBV患者，但治愈率仍然很低。
TALEN技术，它可以直接靶向共价闭合环状DNA（cccDNA），并有可能永久地禁用这一重要的病毒复制中间体。从研发难点看，工程核酸酶潜在的脱靶裂解导致毒性是该技术的局限性！为了解决这一问题，在HBV基因治疗背景下，现有的靶向病毒核心和表面开发阅读框的TALEN被第二代和第三代Fokl核酸酶结构域修饰。
作为专性异源二聚体，这些TALEN可以防止Fokl同源二聚化导致的靶标裂解。第二代专性异二聚体TALEN，在沉默乙肝病毒基因表达方面与第一代对应物一样有效，并且在乙肝病毒复制的小鼠模型中，表现出更高的特异性！ZFN和TALEN，被设计为左右单体，它们在预期的DNA靶序列上聚集在一起，允许它们的Fokl核酸酶结构域二聚化并产生双链断裂。
然而，研究人员发现左/左或右/右同源二聚体也可以组装，从而在这些非预期位点进行功能性Fokl二聚化和切割。为了限制这种可能性，第二代和第三代Fokl核酸酶结构域，被确定为仅在发生左/右异二聚化时才起作用。例如，QE与IA和EK以及IV一起产生的ZFN单体作为同二聚体的作用很差，但作为异二聚体却非常有效。
随后一项研究确定了FokI核酸酶结构域的其他修饰，例如ELD（QE、IL、ND）和KKR（EK、IK、HR）突变，从而产生了改进的专性异二聚体ZFN。研究人员还确定了增强Fokl核酸酶结构域催化活性和提高ZFN功效的修饰。这些所谓的Sharkey突变（SP和KE）也可以减少核酸酶的脱靶突变，因为需要较低的剂量才能产生治疗效果。
在这里，我们评估了第二代TALEN（QE、IA、EK和IV专性异二聚体）以及具有Sharkey突变的第三代TALEN（ELD和KKR专性异二聚体）用于抗HBV的用途。总体来说，第二代专性异源二聚体的疗效与最初的第一代抗HBVTALENs的疗效相当。尽管观察到靶向核心ORF的第二代专性异二聚体TALEN对病毒复制的抑制水平相似，但在体内观察到较低的靶标破坏！
相比之下，含有Sharkey突变的第三代TALEN对HBV的沉默活性降低，这一结果与此前已有报道结果类似，这表明将Sharkey突变纳入TALEN结构，更具体地说，纳入第三代Fokl核酸酶结构域，对沉默活性有害。Sharkey突变是由ZFN的定向进化产生的，可能是TALEN内沉默活性降低的原因。
小番健康结语：南非和德国研究人员发表的这项研究，是在说明这种工程核酸酶技术（如TALEN），具有直接靶向和灭活cccDNA的能力，这种能力使得TALEN成为一种值得探索的慢性HBV感染治疗方法。TALEN和Cas9功能，已被证明受异染色质限制。最近数据表明，TALENs在导航紧密DNA方面的表现优于Cas9核酸酶。
这些研究发现在HBV治疗领域很重要，因为cccDNA已被证明以异染色质状态存在。虽然TALEN被异染色质阻碍，但其活性并未完全受到抑制，并且核酸酶能够在异染色质内导航，比Cas9核酸酶更是如此，Cas9核酸酶在询问目标位点之前必须分离双链DNA。病毒DNA的有效靶向依赖于TALEN与靶序列的结合，这可能会被逃逸突变破坏。
HBV测序数据的分析确定了描述TALEN靶位点的有限变异性。此外，需要同时靶向HBV基因组内的多个位点来限制病毒逃逸。脱靶效应的表征和TALEN表达序列的有效传递载体开发，对于该技术最终临床转化仍然至关重要。TALEN技术可以很好地填补抗HBV疗法的重大空白。
解读TALEN技术研发特点和前景
目前医学知识进展至今，发现慢性HBV感染持续性源自于病毒cccDNA，它在感染过程中被确立为稳定的附加型微染色体。实现功能性治愈HBV，包括完全抑制cccDNA活性，这一目标越来越被认为是能够实现的目标，而不是必须完全清除所有病毒库的灭菌治愈。工程核酸酶技术，有可能直接靶向cccDNA，并诱导破坏性突变来永久灭活这种病毒中间体。
研究已于年7月12日由南非威特沃特斯兰德大学、德国弗莱堡大学医学中心研究人员发表在科学杂志《Viruses》上。