重组质粒
PLASMID
双酶切
那都不是事儿大家好，我的名字是质粒！我是独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。由于优点太多，对受体细胞亲和，可以装载外源DNA，具有多种单一切割位点，还有合适的筛选标记，所以老是很光荣地被选为各种基因的载体。
双酶切是我和外源基因重组的常用方法！实验人员们会用两种限制性内切酶在我的身上打开两个缺口，于是我就从环状DNA分子变成了两段线状DNA。工作人员们会回收需要的那一段，将其与外源基因用连接酶进行连接。
双酶切应该注意啥
回收PCR产物
PCR扩增时，给引物两端设计好酶切位点。一般说来，限制酶的选择非常重要。尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，一般都是加3个保护碱基，平衡GC含量。
双酶切时间及其体系
需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要。一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如微升。
纯化问题
纯化PCR产物割胶还是柱式，可能柱式更好一些。因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
连接反应
在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
转化
全量（10μl）加入至μl感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入μl无抗培养基，37℃振荡培养60分钟。取μl铺板。也可离心后余μl。
做转化时，也要进行对照。设4个对照组：
1.拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功。如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切。如没长出克隆，则证明双酶切成功。当然要保证感受态、培养基、连接酶都正常的情况下。
2.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。
3.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。
4.无抗板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况。
几个重要问题
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态。因为连接酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
为验证双酶切是否成功，可做对照：酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性。如两管均成线性可初步判断双酶切成功。
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