一些意外
总会在不经意间发生
自信满满的考试却没拿到理想的分数
美好的假期被突如其来的工作打断
意外不惊奇
在意的是意外来临时该如何去面对
生活如此
实验又何尝不是呢
当DNA酶切出现意外时
您知道怎么去面对么？
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不完全酶切或者完全切不开
可能原因?：内切酶失活
推荐解决方案：
1、查看内切酶的有效期；
2、确保内切酶储存在-20℃，再低于此温度，内切酶活性可能受影响；
3、避免多次冻融（不超过3次），建议使用冰盒储存或取放内切酶；
4、勿将酶储存于无霜冰箱或冰箱开门处：
可能原因?：酶切方案不佳
推荐解决方案：
1、按照内切酶供应商推荐的酶切方案及其所适用的DNA样本类型；
2、确保酶切反应中包含所需的添加物或酶辅因子（如DTT、Mg2+、ATP、活性腺苷甲硫胺酸）；
3、使用随酶提供的酶切缓冲液。双酶切时，按供应商的推荐，需考虑兼容性及其它所需反应条件；
4、按照供应商推荐的最适酶切温度进行酶切，双酶切时若两种内切酶最适温度不一致，按顺序先进行较低温度酶切，再进行较高温度酶切；
5、确保酶切过程中不会因蒸发而使酶切体积减小，否则会使盐浓度增高，从而可能降低酶的活性
可能原因?：内切酶不恰当的稀释
推荐解决方案：
1、避免使用微量体积（0.5μL）内切酶进行酶切，保证足量日常储备，确保每个反应所加酶量准确；
2、勿将内切酶稀释于水或10×反应缓冲液中；
可能原因?：配制酶切体系不恰当
推荐解决方案：
1、在反应体系中最后加入内切酶，加入内切酶后轻弹混匀，确保内切酶不会因甘油密度而沉于管底；
可能原因?：酶切反应混合液中甘油过多
推荐解决方案：
1、酶切反应混合液中甘油浓度应5%，加入内切酶的量不超过总反应体积的1/10，尤其是对于双酶切；
2、避免因蒸发而使反应体积减小，从而导致甘油浓度增高；
可能原因?：酶切DNA浓度不合适
推荐解决方案：
1、酶切反应混合液中DNA浓度的最佳范围为20-ng/μL；
可能原因?：DNA污染
推荐解决方案：
1、通过离心柱纯化、酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除残留的SDS、EDTA、蛋白、盐分、核酸酶，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀，以去除EDTA和盐分；
2、当酶切未经纯化的PCR产物时，PCR产物体积应不超过酶切总体积的1/3（如30μL酶切总体积中PCR产物体积不超过10μL）；
3、如果DNA是经硅膜或树脂纯化，需00×g离心10分钟已去除残余粒子；
可能原因?：DNA中找不到内切酶识别序列
推荐解决方案：
1、重新检查DNA模板，或通过测序检查；
2、如果通过PCR引物引入酶切识别序列，确保引物序列包含酶切识别序列且5’端有4-8个保护碱基；
3、查看所用内切酶是否需要不止一个识别位点才能发挥完全活性，添加含识别序列的DNA寡核苷酸或亚精胺可提高那些至少需要两个识别位点内切酶的活性（如AarI、SfiI）；
可能原因?：甲基化影响
推荐解决方案：
1、查看内切酶的甲基化敏感性。如果内切酶受识别序列甲基化影响，尝试用异裂酶或同裂酶替代（如MvaI替代EcoRII）；
2、为了避免DNA的甲基化，在dam–/dcm–型大肠杆菌中复制质粒；
3、如果内切酶需要识别序列甲基化才能发挥功能（如DpnI、SgeI），在dam+/dcm+型大肠杆菌中复制质粒；
可能原因?：DNA结构影响
推荐解决方案：
1、对于超螺旋的质粒DNA，其酶切位点可能被包埋，使用经验证可消化完整质粒的内切酶，如有必要，适当加大酶用量（如每μgDNA5-10units酶）；
2、对于线性DNA而酶切位点临近末端，检查完全酶切所需的额外碱基；
3、如果在质粒多克隆位点内进行双酶切，检查酶切位点临近序列，是否具有进行完全酶切所需的碱基数量，如果距离太近，两种酶切可能会互相影响；
可能原因?：水中有杂质
推荐解决方案：
1、将水离心（10min，00×g）以去除水中污染物；2、做阴性酶切对照，以水代替酶以检测水中核酸酶和细菌污染物的影响；
3、推荐使用新鲜的无核酸酶、分子生物学级别的商品化水；
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出现预期外的酶切条带
可能原因①：内切酶星号活性
推荐解决方案：
1、酶用量不要超过推荐用量，如有必要可适当减少酶用量；
2、避免过度长时间酶切；
3、使用推荐的反应缓冲液。低盐、不合适的PH、除了Mg2+外的二价阳离子可能引起星号活性；
4、确保酶切反应中甘油浓度不超过5%；
5、避免因蒸发而使反应体积减小，进而增大甘油浓度和盐浓度；
可能原因②：其它内切酶污染
推荐解决方案：
1、使用一管新酶或新缓冲液，不恰当的实验操作可能使内切酶或缓冲液被另一种内切酶污染；
可能原因③：其它DNA污染
推荐解决方案：
1、重新制备新的样本DNA；
可能原因④：DNA迁移缓慢
推荐解决方案：
1、在电泳前加入含0.2%SDS上样缓冲液后，将酶切DNA在65℃加热10分钟，可使与底物DNA仍结合的酶分离；
可能原因⑤：底物DNA中出现未预期的识别序列
推荐解决方案：
1、重新检查克隆策略及连接位点，DNA结构中新出现的识别序列可能被忽视；
2、通过Sanger测序检测DNA序列完整性。突变可改变模板中的识别序列；
3、甲基化可能影响酶切（如MboI受甲基化抑制，而DpnI需要甲基化）；
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出现弥散的DNA条带
可能原因?：DNA质量差
推荐解决方案：
1、通过电泳检测未酶切的DNA，如观察到降解则重新纯化DNA；
可能原因?：试剂污染
推荐解决方案：
1、如有必要，制备新的试剂，使用新的内切酶或者重新纯化DNA，不恰当的操作可能使反应组分被核酸酶污染；
可能原因?：DNA迁移缓慢
推荐解决方案：
1、在电泳前加入含0.2%SDS上样缓冲液后，将酶切DNA在65℃加热10分钟，可使与底物DNA仍结合的酶分离；
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