白癜风容易治吗 https://m-mip.39.net/disease/mipso_5602607.html生物的遗传信息主要贮存在DNA中，而DNA由AGCT四种碱基、核糖、磷酸基团等组成。碱基上可以发生化学修饰，最常见的形式是胞嘧啶C的第5位碳原子的甲基化，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化具有重要的生物学功能，是表观遗传的核心研究内容。为了检测基因组中的DNA甲基化，研究者们开发了大量的方法，如何从中选择出适合自己研究的DNA甲基化检测方法逐渐成为了一门学问。今天要跟大家分享的是DNA甲基化（此处特指5mC）检测方法的选择策略。选择合适的方法就像找对象，不一定那个长的最好看的那个就最好，最合适的才是最好的。今天的内容主要分为三个部分：首先，我们需要搞清楚为什么要检测DNA甲基化，检测DNA甲基化能够回答什么关键的科学问题；第二部分，我们将重点解读，如何从五花八门的方法中，选出最适合你的那一款；第三部分，通过几个具体的案例，来帮忙我们消化和理解。为什么要检测DNA甲基化？首先，我们为什么要检测DNA甲基化呢？检测DNA甲基化能回答什么问题？我们都知道，DNA甲基化可以调控基因表达，因此检测DNA甲基化至少可以为解释基因表达的调控提供一些线索。其次，DNA甲基化参与一系列重要生物学过程，包括早期胚胎发育、基因组印记、X染色体失活、重复序列的沉默以及癌症的发生发展转移，DNA甲基化也有助于阐明这些重要的生命过程背后隐藏的奥秘。此外，DNA甲基化一个非常重要的应用，是可以作为肿瘤的生物标志物。DNA甲基化如此重要，我们可能需要时刻想着它。图1.DNA甲基化的几种应用场景所谓知己知彼，百战不殆，我们还得知道我们要检测的DNA甲基化在人基因组内的基本情况。人类大约有30亿个碱基对，DNA主要发生在CpG二核苷酸上，基因组中大约有万个CpG位点。这些CpG位点中，大约60~80%被甲基化，而在一些特定的区域，比如启动子，存在CpG位点富集的序列，我们称之为CpG岛，CpG岛通常未被甲基化。但是在肿瘤细胞中，整体甲基化水平降低至20~50%，与正常细胞相比，即可能有10~60%的CpG位点的甲基化状态发生了改变，也就是大约~万个CpG位点。图2.人类基因组中DNA甲基化概况总体而言，人类基因组中DNA甲基化位点数量巨大，要搞清楚每个位点的DNA甲基化状态，技术难度大，而且很烧钱。庆幸的是，很多时候我们并不总是需要检测全基因组的DNA甲基化状态。图3.DNA甲基化检测方法简要的时间轴根据不同的实验目的，研究者已经开发了众多DNA甲基化检测方法。这些方法包括重亚硫酸盐转化测序（BS-Seq）、MeDIP-Seq、RRBS-Seq、WGBS、MBD-Seq、SMRT等，还有比较新的方法，比如纳米孔测序以及我们实验室今年发表的“导向定位测序（Guidepositioningsequencing，GPS）”。当然，甲基化检测方法并不止这些，甲基化检测方法多达上百种。我这样说完，估计大家还是一头雾水。接下来，我会按照我们实际研究过程中的思考逻辑，对现有的主流DNA甲基化检测方法进行分类解读。DNA甲基化检测方法的选择策略我的策略是提几个问题。首先，摸一下自己的口袋，或者查一下自己课题组的银行账户，我有钱吗？如果你想要做全基因的DNA甲基化，并不便宜，有钱才好办事。第二个问题，检测DNA甲基化要花多久？我如果希望做短平快的课题，不要让我搞好几年才有结果，或者研究生急着要毕业。当然，如你所愿，有一些快速评估DNA甲基化的方法。第三个问题，我打算检测cfDNA的甲基化，DNA量非常少，这个时候我该怎么办？也不用担心，也有一些适合微量DNA的甲基化检测方法。最后，我有钱也有样本，使用这种方法，最后产生什么样的数据，我可以发表什么样的文章呢。图4.选择方法前四个令人陷入沉思的问题这四个问题是我们在开始选择DNA甲基化检测方法时需要认真考虑的。当然，这是四个问题的通俗版本。从实际课题研究的角度，我们有另外四个问题，引导我们选择合适的DNA甲基化检测方法。第一个问题是，我们要检测整体的（global）甲基化还是位点特异性的甲基化。需要特别强调的是，global并不等于genome-wide，global是看整体DNA甲基化的高低，但是不知道特定基因或者特定位点的DNA甲基化水平。这就好比两袋糖果，你称一下，知道一袋糖果比另一袋更重，但是你并不知道这一袋糖果中，每一颗有多重，你无法对每一颗的重量进行比较。当然，有时候，我们可能需要先知道整体的变化情况，比如我们刚才提到的，肿瘤细胞中整体低甲基化。如果我要检测整体的DNA甲基化的高低，我该使用什么方法呢？图5.四个问题2.0版本之第一个问题GlobalDNA甲基化的检测HPLC-UV一种比较简单快捷，不需要繁琐建库过程的方法是HPLC-UV。首先使用DNaseI、NucleaseP1和碱性磷酸酶三种核酸酶将DNA水解为单个核苷，随后通过高效液相色谱分离不同的核苷，最后在nm和nm下检测吸光值，计算dC和5mdC的含量[1]。对于HPLC而言，首先，你得有高效液相色谱仪可用，而且需要的DNA量为1-5ug。图6.基于HPLC-UV的DNA甲基化检测[2]LC-MS/MS如果采用色谱和串联质谱联用，可降低对起始DNA量的需求，起始DNA50-ng即可，还有文献报道用5ngDNA进行检测[3]。LC-MS/MS对于不同质量的DNA没有偏好性，比如低质量的FFPE样本，这就像你吃东西的时候，不管你吃的山珍海味还是粗茶淡饭，到肚子里面都差不多。显而易见的是，这种方法依赖于色谱和串联质谱仪，还需要专业的操作人员。当然，医院或者机构有这样的设备，LM-MS/MS其实是很好的方法。图7.基于LC-MS/MS的检测方法基于ELISA的方法还可以用基ELISA的方法快速估计DNA甲基化的水平。先将DNA结合到反应孔中，洗掉未结合的DNA；加入5mC特异性抗体，然后加入用于检测的二抗，加入显色剂，测量吸光值。甲基化的DNA越多，ODnm的值越高。基于ELISA的方法优缺点很明显，优点是非常快速，而且操作简单，缺点是结果不稳定，干扰因素比较多，适用于检测整体DNA甲基化非常显著的情况，比如整体DNA甲基化水平变化了1.5-2倍。基于ELISA的方法需要的DNA量为ng-2ug，而且目前市面上有多种可选择的试剂盒。图8.基于ELISA的方法（图片来源：EpigentekMethylFlashMethylatedDNA5-mCQuantificationKit）重复序列DNA甲基化第四种方法是检测人类基因组中的重复序列的DNA甲基化高低。人类基因中蛋白质编码序列大约只占了1.5%，人类基因组中含有大量的重复序列，包括LINE-1、SINE、LTR等。一种简便的评估整体DNA甲基化水平的策略是，检测LINE-1的甲基化，作为整体DNA甲基化水平的替代。图9.人类基因组中存在大量的重复序列（图片来源：