年5月25日，北京分子科学国家实验室，北京大学化学与分子工程学院雷晓光课题组，联合天然药物功能国家重点实验室等机构，在《NatureChemistry》杂志上发表以“FAD-dependentenzyme-catalysedintermolecular[4+2]cycloadditioninnaturalproductbiosynthesis”为标题的文章，解析了传统中药桑白皮中的活性天然产物生物合成关键步骤，报道了自然界中存在的首例催化分子间Diels-Alder反应的单功能酶，为多年来存在的一个重要科学争论：“自然界中是否有真正意义的分子间Diels-Alder反应酶”画上了句号。
植物天然产物作为内源性小分子参与了自身重要生理活动，例如调控植物自身的生长发育以及抵御病虫害，同时也是治疗人类重大疾病的创新药物分子的主要来源。因此，解析植物天然产物的生物合成途径对于植物生物学、生态学研究、以及开发创新药物治疗人类重大疾病都具有重要意义。然而由于植物自身的特点(生长缓慢，基因组庞大)以及参与生物合成的基因往往不成簇分布的现象，植物天然生物合成研究方法有限，进展缓慢。
在本文中，雷晓光课题组开发出一种基于天然生物合成中间体分子探针(BiosyntheticIntermediateProbes，BIPs)的靶标垂钓策略(如图1所示)，并与合作者一起通过结合植物天然产物生物合成研究中的常规手段(活性导向蛋白分离以及转录组测序等方法)，成功在桑树愈伤组织中鉴定出两个FAD依赖蛋白(MaMO和MaDA)，其中MaDA被进一步证明为自然界中存在的首个催化分子间Diels-Alder反应的单功能酶。该基于“天然产物生物合成中间体分子探针”的化学生物学研究策略，为解析植物天然产物生物合成途径提供了新的研究思路。
图1，桑树中D-A类型天然产物可能的生物合成途径以及基于生物合成中间体探针的靶点垂钓
在成功鉴定出MaDA后，作者进一步探索了其底物适应性，并对该酶促分子间Diels-Alder反应的机理进行了深入探讨，证明了MaDA是真正意义上的单功能分子间Diels-Alder反应酶。为了进一步探索MaDA的催化机制，雷晓光课题组成功解析了MaDA的晶体结构，在此基础上，进行了分子对接以及定点突变实验。结果显示，F，R，F，I以及Y对于维持MaDA的活性至关重要，同时，作者还发现氧化态的FAD对于MaDA的活性也非常重要，如图2所示。
图2，基于MaDA晶体结构的分子对接以及点突变实验揭示了MaDA与底物形成相互作用的关键位点
综上所述，研究者通过活性导向蛋白分离，基于生物合成中间体探针(BIPs)的靶点垂钓和转录组分析相结合的策略成功在桑树愈伤组织中鉴定了两个FAD依赖的蛋白，MaMO和MaDA。其中，MaDA为首例催化分子间[4+2]环化反应的单功能酶。作者通过DFT以及KIE实验证明了该酶促反应为协同但不同步的Diels-Alder反应，因此MaDA是首个从自然界中发现的、催化分子间反应的Diels-Alder反应酶，从而结束了学术界一直存在的“自然界是否有真正意义DA反应酶”的争论。作者还成功解析了MaDA的晶体结构，并初步阐明了底物和蛋白相互作用的机制。此外，MaDA有很好的底物宽泛性，利用MaDA实现了多种D-A类型天然产物的酶法合成。该酶法合成展现出普通化学方法难以实现的高效性与立体化学专一性，体现了MaDA在生物催化中的优势和特点，为发展酶催化合成方法来高效制备结构多样的功能有机分子开辟了新的研究方向。此外，本研究所提出的基于天然产物生物合成中间体分子探针(BIPs)靶点发现的化学生物学研究手段也会为阐明天然产物生物合成途径、发现新颖的生物合成酶提供新的研究方法与思路。最后，该类药用植物来源天然产物生物合成途径的解析也为后继合成途径重建，实现植物天然产物的微生物异源生物合成，并开展结构衍生化研究，提升功能活性铺平了道路。
划重点：
本文中使用德国ImplenNanophotometer?超微量分光光度计测量不同条件下MaDA在nm处的吸光度的变化。并获得了可靠的数据支持。
如图所示，不同条件下MaDA在nm处的吸光度数据不同。a,MaDA(34μM)在nm处的吸光度，每5分钟检测一次加入或不加入6.6mMsodiumdithionite(约eq)的MaDA(34μM)在nm处的吸光度，说明MaDA的还原形态在sodiumdithionite过量时至少在30分钟内是稳定的。实验分别重复三次，结果相似。b,检测在同一蛋白浓度(34μM)中MaDAwt,MaDAHAandMaDAHA-FAD在nm处的吸光度数，将MaDAHA在1mKBr溶液中透析，去除非共价FAD。Absorbancevaluesofnm代表三个独立重复的平均标准差(s.d.)。
德国ImplenNanophotometer?系列超微量分光光度计，除了进行核酸及蛋白定量之外，在全光谱吸光检测领域也有很好的表现，设备仅需0.3μl样品体积，仅需2.5秒即可完成-nm全光谱扫描，并提供所有测量数据。良好的准确度和数据可靠性，完全满足国家级实验室和顶级期刊的数据要求。
设备的光学系统非常稳定，且光谱带宽、重复性、吸光值准确性等关键性能优异，速度快，准确度高，非常适合于众多化学物质的测量。
非常高兴我们的设备被广泛的应用于科学领域，为科技的发展贡献力量。Nanophotometer?将不遗余力的继续助力科学，服务用户。
如您想了解Nanophotometer?的产品，请联系我们：
ImplenChina:
因普恩(北京)国际贸易有限公司
TEL：86-10-
Implen网站：