「导读」
第一作者：TobiasWeikert
通讯作者：AnnaNiehues
单位：明斯特大学
摘要Abstract壳聚糖酶可用于生产不同用途的部分乙酰化壳寡糖(paCOS)，前提是对其进行了充分的表征。然而，最近的研究表明，现有的壳聚糖酶分类系统过于简单化。在这里，我们应用一种高度灵敏的方法对paCOS进行定量测序，以重新评估特征最好的I-III类壳聚糖酶的底物特异性。这些酶在亚位点(?1)或(+1)处的GlcNAc残基裂解键的能力不同，特别是当底物具有不同的乙酰化程度(FA)时。在更高的FA中观察到与最新分类的冲突，这在先前的特异性测定中没有被调查。对果胶降解酶的初步分析表明，其他多糖降解酶的分类也应该进行严格的重新评估。基于我们的结果，我们初步提出了一个基于亚位点(?2)到(+2)的特异性和偏好的壳聚糖酶分类系统。THEEND研究意义葡聚糖、果胶、壳聚糖等是一类具有良好生物活性的大分子，其生物活性一般都是通过酶解后的寡糖进行应用的。降解酶的底物结合位点由多个亚位点组成，每个亚位点带有偏好性的结合一个糖基残基，这种特异性的差异常常用来作为多糖降解酶分类的依据。但没有能够准确确定这些特异性的工具，在这里，我们描述了利用最近发展起来的定量质谱测序方法对部分乙酰化壳聚糖低聚物进行详细分析，从而定量地重新分析壳聚糖酶的亚位点特异性。结果使我们对目前根据壳聚糖酶的亚位点特异性将其分类为I-IV类的做法提出了质疑，这对其他多糖降解酶具有潜在的意义。
要获得可重复生物活性的部分乙酰化壳寡糖（paCOS），不仅要考虑聚合度（DP）和FA，还要考虑它们的乙酰化模式（PA）。底物的FA一定程度上会影响酶的切割效率，此外，高底物浓度会导致底物抑制并降低切割效率。因此，目前的分类如果是在不同条件下进行的，将会产生很大的误导性。此文献的研究重点就是在同等条件下，使用最先进的技术重新评估不同类别的壳聚糖的底物特异性，使用的酶包括链霉菌N产的壳聚糖酶（CSN-，代表Ⅰ类）、芽孢杆菌7-M产的壳聚糖酶（CSN-7M，代表Ⅱ类）、环状芽孢杆菌MH-K1产的壳聚糖酶（CSN-MHK1，代表Ⅲ类）和芽孢杆菌MN产的一种未分类的GH8家族的壳聚糖酶（CSN-MN，序列分析属于Ⅱ类，但行为分析类似于Ⅲ类），Ⅳ类壳聚糖酶不进行比较。
研究内容用定量测序的方法对（-2）到（+2）亚位点上GlcN和GlcNAc的偏好性进行量化，并在不同时间段研究了不同FA底物壳聚糖酶的特异性，并与已建立的分类系统进行比较分析。不同壳聚糖酶性质研究：先构建重组质粒，并在大肠杆菌中表达，之后进行纯化（图1）。将这些酶与乙酰化程度不同的底物（0.11、0.19、0.35和0.50）进行反应，水解48h，并在46h时加入新鲜的酶，确保底物被充分水解（图2）。用折射率检测(RID)的尺寸排除色谱(SEC)分析了FA为0.19和0.50的壳聚糖水解物的粒度分布（图3）。结果表明，壳聚糖酶的裂解效率受到底物FA的强烈影响。底物的增加导致活性降低，并伴随着产物的DP分布从较小的齐聚物向较大的低聚物转移。图1.电泳结果。M是标准蛋白，1是ChiB，2是CSN-，3是CSN-7M，4是CSN-MN，5是CNS-MHK1图2.水解结果。(a)CSN-，(b)CSN7M，(c)CSN-MN和(d)CSN-MHK1图3.(A)CSN-、(B)CSN-MN和(C)CSN-MHKI产生的低聚物的聚合度分布。FA为0.19(黑色)和0.50(红色)从测序的paCOS推断亚位点偏好：对不同FA值的壳聚糖的水解产物进行定量测序分析，分析不同底物乙酰化程度对末端糖单元乙酰化模式的影响。将不同酶定量分析的结果得到的推断的特异性与定性分析结果的特异性进行比较（图4-7）。
图4.CSN-N产物分析。（a）酶解产物定量测序结果。（b）各亚位点（-2到+2）相应的GlcN（蓝色）和GlcNAc（白色）的占比图5.CSN-7M产物分析。（a）定量测序结果。（b）各亚位点糖基占比图6.CSN-MN产物分析。（a）定量测序结果。（b）各亚位点糖基占比图7.CSN-MHK1产物分析。（a）定量测序结果。（b）各亚位点糖基占比Ⅰ类壳聚糖酶CSN-特异性分析：CSN-的产物在还原端主要含有GlcN-GlcN和GlcN-GlcNAc二联体（图4a）。结果表明，CSN-至少可以切割聚合物底物中的GlcN-GlcN│GlcNAc-GlcN和GlcN-GlcN│GlcNAc-GlcNAc基序，甚至可能切割GlcN-GlcNAc│GlcNAc-GlcNAc（图4b）。以前将CSN-归类为I类壳聚糖酶(裂解GlcN│GlcN和GlcNAc│GlcN)是基于对FA在0.25-0.35的壳聚糖水解物的分析(图4b)。同样，在我们的研究中，在乙酰化≤为0.35时，尤其是在裂解的初始阶段，CSN-的特异性可能被误认为是符合I类的特异性。当底物被乙酰化≥0.35的部分长时间切割后，该酶还切割了GlcN-GlcN│GlcNAc-GlcN和GlcN-GlcN│GlcNAc-GlcNAc基序，这与其属于I类壳聚糖酶的分类相悖。这些条件下的产物表明CSN-具有适合IV类的特异性，因为它可以切割除GlcNAc│GlcNAc之外的所有模式。有趣的是，活性位点的(?2)位置显然总是被GlcN单元占据。(?2)亚位点是唯一一个对GlcN有绝对特异性的亚位点，而其他亚位点只显示出对GlcN的偏好。
Ⅱ类壳聚糖酶CSN-7M和CSN-MN特异性分析：CSN-7M的产品还原末端总是完全由GlcN-GlcN组成。在低FA时，非还原末端的最大部分也由GlcN-GlcN组成，在高FA时，非还原末端增加了GlcN-GlcNAc和GlcNAc-GlcN。因此，CSN-7M能够切割GlcN-GlcN│GlcN-GlcNAc基序。(?2)和(?1)似乎都是GlcN单位的绝对专一性，而(+1)和(+2)亚位点仅表现出对GlcN的强烈偏好。此外，我们发现大量GlcNAc-GlcN-GlcN-GlcN和GlcNAc-GlcN-GlcN片段，因此推断，CSN-7M还可以切割GlcN-GlcN│GlcNAc-GlcN基序，将其归类为Ⅲ类。与我们的研究相比，先前的研究使用了更高的底物浓度和更短的孵育时间，这可能导致了底物抑制的增加并且聚合物底物的切割不完全。这可以解释为什么我们的研究结果与以前报道的结果相反。目前尚不清楚是否有GlcN-│-GlcN具有绝对特异性的壳聚糖酶，这是将其归类为II类壳聚糖酶所必需的。而CSN-MN和CSN-7M在氨基酸水平上有97%的同源性，我们研究的数据表明CSN-MN的特异性与CSN-7M几乎相同，这一发现支持了我们的结论。
Ⅲ类壳聚糖酶CSN-MHK1特异性分析：CSN-MHK1(图7a)形成的还原端完全由二联体GlcN-GlcN组成，在乙酰化的低组分，CSN-MHK1产物的非还原末端以GlcN-GlcN和GlcN-GlcNAc形式存在。随着底物FA的增加，GlcN-GlcN的丰度降低，GlcN-GlcNAc的丰度增加。GlcNAc-GlcN和A-A丰度仅略有增加。因此，GlcN-GlcN│GlcN-GlcN基序的切割效率比其他基序的切割效率高得多，GlcN-GlcN│GlcN-GlcNAc比GlcN-GlcN│GlcNAc-GlcN和GlcN-GlcN│GlcNAc-GlcNAc更具选择性(图7b)。，(?2)和(?1)亚位点对GlcN表现出绝对的特异性，而(+1)和(+2)亚位点仅对GlcN表现出强烈的选择性。
研究结论我们的详细和定量数据表明，目前的壳聚糖酶分类系统通常过于简单，因为它基于酶在底物中切割特定序列基序的基本能力，而只基于亚位点(?1)和(+1)的特异性，而忽略了切割模式的定量效率。因此，它不能很好地解决壳聚糖酶的底物特异性或偏好，它对产物的影响，以及最终不同壳聚糖酶之间的差异。因此，以前用这个系统分类的壳聚糖酶的行为必须受到怀疑，且修改后的分类必须包括其他亚位点。还需要对更多的壳聚糖酶进行详细的研究，才能得出确切的结论。与底物乙酰化程度较低的底物产生的壳聚糖酶产物相关的PA误导性地暗示了比本研究中使用的乙酰化程度较高且孵育时间较长的底物所产生的壳聚糖酶产物具有更高的特异性。虽然我们认为亚位点特异性是一种酶的固有特性，它不会随着孵育时间或底物乙酰化程度的不同而改变，但不同键被水解的速度不同会导致两相曲线，从而导致在使用单一底物或单一孵育时间时得出错误的结论。因此，当壳聚糖酶作用于不同乙酰化程度的底物和孵育过程中的不同时间点时，在不调查其产物的情况下对壳聚糖酶进行有意义的比较和分类似乎是不可行的。
在本研究中只定义了两类壳聚糖酶：一种酶只在(?2)上对GlcN单元有绝对专一性（Dd│dd），我们给其命名为B类壳聚糖；另一种酶在(?2)和(?1)上对GlcN单元都有专一性（DD│dd），我们给其命名为A类壳聚糖。其中“D”代表对GlcN单位的绝对特异性，“d”代表对GlcN单位的强烈偏好。亚位点(?2)对所有被测试的酶中的GlcN-单位都是绝对特异的，但它并不是一种普遍的特性，来自循环芽孢杆菌WL-12的壳聚糖酶可以同时接受该亚位点上的GlcN-单位和GlcNAc-单位。很有可能随着时间的推移，随着对更多酶的研究，将不得不增加更多的类别和/或定义亚类。
我们坚信，这些发现对其他多糖及其降解酶也很重要，特别是作用于其他二元多糖的酶，即由两个不同糖基单位组成的线性多糖，如海藻酸盐、透明质酸和葡糖氨基葡聚糖，或一些果胶。这项工作的结果强调了重新评估现有的基于亚位点特异性的壳聚糖酶和其他多糖降解酶的分类系统的重要性，特别是因为聚合物底物和寡聚产物的取代模式(如壳聚糖中的乙酰化或果胶中的甲酯化)已被证明是可重复生物活性的一个非常重要的属性。因此，这项研究的结果对于深入理解多糖序列的生理作用以及微调特定产品的有效生产过程以获得可靠的应用是非常重要的。
END「前期回顾」ChemComm非保守底物结合位点直接影响中链乙醇脱氢酶的立体选择性
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