今天勺子当一回老师，给大家简单讲解一下分光光度技术，这也是医学生物化学与分子生物学实验技术不可或缺的一项~
首先是分光光度技术的介绍
分光光度技术(分光光度法)是利用紫外光、可见光、红外光以及激光等测定物质的吸收光谱，并对物质进行定性、定量以及结构分析的技术。
分光光度计一般用于吸光度测定和吸收光谱的扫描，从而对溶液中物质进行定性定量分析。在生化实验中主要用于氨基酸、蛋白质、核酸等物质含量的测定、生物高分子的鉴定、酶活力测定以及酶促反应动力学的研究等。
1.溶液的定性分析
物质的吸收光谱与其结构和性质有关。不同物质由于分子结构不同，因此对不同波长的光的吸收能力也不同，每种物质都具有独特的吸收光谱。不同物质的吸收光谱曲线各不相同，相同物质的吸收曲线则是一样的。同种物质在不同浓度时，其吸收曲线中峰值可能不同，但吸收曲线形态相似，吸收高峰和低峰的波长是-定的。依据这一原理，将待测物质的吸收曲线与已知纯物质的吸收曲线相对照，即可判定它们是否为同一种物质。
利用分光光度计可以绘制物质的吸收光谱曲线，方法是用各种波长的单色光分别通过待测溶液，测定溶液对每一种单色光的吸光度，再以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，找出其最大吸收波长，以此作为定性分析的依据。
紫外吸收光谱分析可用于鉴定化合物，但主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。物质吸收紫外线是由不饱和结构引起的，含有双键的化合物对紫外线表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照(须注意测定的条件，如溶剂、浓度等)。常用标准的紫外吸收光谱是Sadtler公司编制的“紫外标准图谱集”，到20世纪70年代末已收集个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图多幅。
由于化合物紫外线吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时应注意:同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同，因此，单独依靠紫外吸收光谱鉴定某--未知物结构时，必须与其他方法配合。
2.溶液的定量分析
当液层厚度一致时，溶液的吸光度与其浓度成正比，因此，两种不同溶液的吸光度之比等于它们的浓度之比。使用等同的比色杯，以已知浓度的标准液的吸光度为参照，与待测溶液的吸光度进行比较，即可求出待测溶液的浓度，
计算公式如下:
上式中，Cx和Ax为待测液的浓度和吸光度值;Cs和As为标准液的浓度和吸光度值。
接着咱们简单了解一下分光光度计的结构
下图为分光光度计的基本组成：
1.光源
不同光源发出的光的波长范围不同。理想光源的条件是:①能提供连续的辐射;②光强度足够大;③在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化;④光谱范围宽;⑤使用寿命长，价格低。常用的光源有白炽灯(钨灯、卤钨灯等)、气体放电灯(氢灯、氘灯、氙灯等)、金属弧灯(各种汞灯)等。
2.分光系统
分光系统(单色器)是分光光度计的心脏部分，能把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是:①入射狭缝:限制杂散光进入;②色散元件:即棱镜或光栅，转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长;③准直镜:把来自入射狹缝的光束转化为平等光，并将来自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上;④出射狭缝:只让额定波长的光射出单色器。
3.样品室
样品室包括池架、吸收池(即比色杯)以及各种可更换的附件。
池架有普通池架和恒温池架，恒温池架又有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为0.1C，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达0.05C。
比色杯用来装溶液，-般由玻璃、石英或萤石制成。由于普通光学玻璃吸收紫外光，因此光学玻璃杯只能用于可见光，适用波长范围是~nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光，适用波长范围是~nm，是最常用的比色杯。
使用比色杯时要注意:①比色杯用后要及时清洗②严禁用手指触摸透光面，只能使用镜头纸和绸布;③严禁加热烘烤，不可用超声波清洗器清洗;④比色杯的校正要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上作记号。
4.检测器
检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来。常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管3种。
5.显示器
低档分光光度计现在都已采用数字显示，有的还连有打印机。高性能分光光度计可连接计算机和打印绘图机，存取数据更加方便。
常用分光光度计的使用方法
其实，国产分光光度计近年来已有很大的发展，各种档次的分光光度计都已升级换代，可见光系列有:、、等型号;紫外/可见光系列有:、、、、等型号。以下介绍几种常用的国产分光光度计的使用方法。
1.e型分光光度计
(1)开机预热:开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡住光路，光路上有东西将影响仪器自检。打开电源开关，预热20min。
(2)波长设置:选择所需波长。每次波长重新设置后都要设置透光度。
(3)透光度设置:将空白液、标准液和待测液分别倒人比色杯，液面约在比色杯高度的3/4处。将挡光体、空白管、标准液及样品依次插人比色架，并放进样品室，盖好样品室盖。当挡光体正对光路时，按“0%T”键调透光度为0;当空白管正对光路时，按“%T"键调透光度为%。
(4)测吸光度或透光度:按“MODE”键，将测试方式设为吸光度(A)或透光度(T),将标准液和待测液依次拉人光路，所显示的数值即为标准液和待测液的吸光度或透光度。
(5)比色完毕，打开盖取出比色杯，倒出液体,洗净比色杯，关掉电源。
2.s型分光光度计
(1)开机预热:开机预热30min。
(2)波长设置:选择所需波长。
(3)透光度设置:打开机盖，按“0%”键调透光度为“00.00”;关闭机盖，按“%”键调透光度为“.0”。重复两次。
(4)加样:将空白液、标准液和待测液分别倒人比色杯(约杯高的2/3体积)，并依次插人比色杯架上，放入比色室，使空白管对准光路，盖上比色室盖，按“%”键调透光度为“.0”。
(5)改变标尺:按MODE键将标尺由TRANS转到ABS档。
(6)读取数据:移动推拉杆使比色杯进人光路，定位后读取相应样品的吸光度。
(7)比色完毕，打开盖取出比色杯，倒出液体，洗净比色杯，关掉电源。
3.Sp-紫外可见分光光度计
(1)开机后，仪器自动质检约2min,质检完毕自动进入主菜单界面，关上机盖预热半小时。按F1PhotometricMode,系统进入光度计基本模式，即光度测量模式。
(2)按SETW.1.选择测试的波长，然后放人空白管按Zero键。
(3)按Mode键选择测试方式，进行T/ABS的转换。
(4)将待测样品放入光路中，拖动滑竿进行测量。
(5)按Print键打印测试数据。
(6)用完后退回待机状态，关闭电源，并登记使用情况。
好啦，今天的内容就到这里啦，想做好科研，磨练好实验技术也是非常重要的一件事，祝大家早日发出文章~
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