质粒构建详尽版（二）
实验步骤
质粒构建及鉴定
扩1.使用设计好的引物进行
（使用准备好的模板，模板尽量选择目的基因高表达的细胞或组织，模板的制备具体涉及到RNA的提取、cDNA的反转录等实验过程，这些方面此处不加赘述，如采用成品的试剂盒，则具体实验过程参照说明书即可，如果是经典的实验方法则具体的实验步骤可在网上查询或留言；根据设计引物时的Tm值及GC含量等参数，设置PCR条件，退火温度先以低于Tm值3-5℃为宜，此处Tm值指的是包含保护碱基和酶切位点在内的全序列，因为理论上在PCR的第3个循环即有一半的模板为全序列互补的，如有必要可设置退火温度的梯度进行优化）
胶2.PCR产物琼脂糖凝胶电泳
（最好在PCR时设置无模板对照（NTC），跑胶时有利于确定引物二聚体的位置，同时也有利于辨别特异性扩增的条带；将上述PCR产物全部（可根据目的基因的表达情况调整用量）加入琼脂糖凝胶的上样孔，琼脂糖凝胶一般选择1%即可，跑胶电压V，30min左右即可）
收3.切胶回收
（将上述跑好的琼脂糖凝胶放置于凝胶成像仪紫外灯下，参照NTC组和目的片段的理论大小确定目的条带，PCR扩增难免会有非特异扩增的产物条带，理论上你的目的条带应该是最亮的，如此可直接进入下一步实验；否则就要在引物设计和PCR条件上找原因了，一般只要目的片段理论大小的位置有条带尽管不是最亮的，而NTC在该位置没有条带，同样也可以进入下一步实验；凝胶回收的实验一般均采用成品试剂盒，如国产的天根和进口的Axygen等均可，具体实验步骤按说明书进行即可；对于凝胶回收，4℃放置过夜溶胶会比直接按试剂盒中高温水浴快速溶解回收效果好，对于回收效率极低的情况可以尝试）
切4.双酶切克隆产物和空载
（胶回收后PCR产物和空载体同时分别进行双酶切，双酶切体系可参考限制性内切酶的商家说明书，如NEB或TaKaRa，需要注意的是内切酶都有对应的反应Buffer，如果使用不合适可产生型号活性，所以在酶切位点选择是也要参考这方面的因素进行综合选择，如下为TaKaRa给出的双酶切内切酶配对Buffer表（部分），如要完整表单可在TaKaRa