1，制备型IEF-FFE技术可实现抗体电荷异构体高分辨连续液相分离；
2，icIEF分析证明了这两种技术之间馏分的纯度和电荷分布的可比性；
3，完整的分子量分析表明，糖化修饰在酸性变体中高度富集；
4，开发了SEC-UV/FL方法来评估聚集和荧光高级糖基化终产物（AGEs）的水平；
5，进行了详细的肽图分析。
结果表明和起始原料相比，酸性峰富含AGEs、蛋氨酸／色氨酸／组氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺、赖氨酸糖基化、赖氨酸羧甲基修饰、甘氨酸的天冬氨酸取代。结果表明，酸性变体可以解释为非常不均一的形式存在的各种低水平修饰。
在年2月，Biogen的研究人员在JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis上发表了一篇文章，采用FFE分离制备了酸峰，并用LC-MS进行了详细的表征。我们试着大概翻译了一下文章，以飨读者！
1，引言重组单克隆抗体的异质性可能由多种途径引起，包括细胞培养条件、下游纯化、制剂加工和储存。这些产品变体可能会对功效、安全性产生负面影响，并限制半衰期。因此，至关重要的是定期监测纯化的抗体变体以确保产品完整性、批次间一致性和稳定性。电荷异质性分析是单克隆抗体表征中最重要的方面之一。与主要物质相比，等电点（pIs）较低的电荷物质被定义为酸性变体。据报道，重组抗体酸性变体中存在许多翻译后修饰。已经有报道指出唾液酸化、天冬酰胺残基的脱酰胺作用、琥珀酰亚胺化、C末端赖氨酸加工和赖氨酸糖基化有助于抗体酸性变体的形成。此外，对电荷变体进行表征以了解关键产品属性及其对安全性和有效性的影响，可以支持在工艺变更期间进行可比性研究，并支持设定适当阶段的质量标准。已有多种色谱和电泳方法广泛用于监测生物制药行业中的重组抗体电荷变异体，包括等电聚焦（IEF），成像毛细管等电聚焦（icIEF）和离子交换色谱（IEX）。1，通过IEX方法进行的抗体电荷变异体分离采用盐浓度梯度来改变离子强度，或利用具有恒定离子强度的pH梯度。分离机理是基于与色谱柱固定相接触的抗体变异体的表面电荷差异。由于可以以非变性条件进行馏分收集并可以进一步表征，IEX方法广泛用于分离生物治疗药物的电荷变异体。色谱方法也可以很容易地按比例放大，以回收和收集足够数量的材料用于其他表征分析。但是，由于色谱柱批次之间不稳定、缺乏分离度和耐用性等原因，有时可能会限制此方法。2，相反，icIEF的IEF可以根据分子的pI分离蛋白质电荷变异体。icIEF分离是通过将蛋白质电荷变体与载体两性离子迁移到带涂层的硅胶毛细管中进行的，而不同的变体在梯度pH中通过施加电场聚焦。与IEX方法相比，icIEF具有更高的分离度、通量和耐用性，非常适合电荷变异体的常规分析，因此已成为监测生物制药电荷变异体的首选释放测试方法。但是，无法从毛细管中收集馏分限制了该方法在其他技术中进一步表征的应用。为了克服icIEF的局限性，已经开发了多个基于等电聚焦的大规模分离系统以允许分馏制备。在这项研究中，我们报告了一种利用自由流电泳（FFE）和其他分析技术（例如SEC、LC-MS等）的电荷变异表征方法。新兴的制备型IEF－FFE技术可实现抗体电荷变体的连续样品分离和制备。在FFE中，异质蛋白样品被连续引入分离室，并通过流体动力流沿着分离室的长度推动。当样品通过分离室时，垂直于流体流动方向施加电场。分离缓冲液中存在的两性离子产生pH梯度，导致基于电荷变体的pI值的等电聚焦。将聚焦的变体推出分离室，并收集成96个单独的馏分。通过FFE收集的馏分使用ProteinA柱进一步纯化，并通过icIEF评估每个馏分的纯度。结果显示该方法成功富集了包含不同酸性变体和主峰的馏分。特定电荷变体的富集允许通过多种分析方法广泛鉴定酸性物质。2，材料和方法2.1.材料抗体分子为Biogen内部产品。质谱级赖氨酰内肽酶购自Wako，测序级Asp-N内切蛋白酶和DTT从SigmaAldrich获得。质谱级乙腈，水和三氟乙酸购自FisherScientific。2.2等电聚焦自由流电泳（IEF-FFE）进行异构体分离和制备IEF-FFE在德国FFEserviceGmbH的系统上执行。IEF分离在××0.5mm的分离室中进行，其中FFE分离条件如下：1，mM+mM吡啶乙醇作为阳极电极缓冲液；2，mM+mMγ-氨基丁酸作为阴极电极缓冲液；3，分离介质为含1.5％Servalyt7-8，0.3％MC和3M尿素的水溶液；4，分离介质流速45mL/h；5，同时将分离室冷却至10℃；6，分离电压2.9kV；7，样品浓度1mg/mL，进样速度1.3mL/h。样品在分离室中的停留时间为约15分钟，之后在PP材质96深孔板上收集组分。测量每个孔的pH值和蛋白质浓度以监测分馏的质量。用乙酸将收集的组分的pH调节至pH6–6.5，以保持抗体的稳定性。FFE馏分在自动CaliperSciclone系统上纯化。在通过ProteinA树脂纯化之前，将样品用水以1：4稀释，以降低样品的粘度和尿素的浓度。最后，将样品用4mLAmicon超滤管（30kDaMWCO）浓缩，并将缓冲液置换为药物制剂缓冲液（10mM柠檬酸钠，mM精氨酸-HCl，pH6.5）。
2.3.icIEF鉴定每个FFE组分使用iCE仪器和来自ProteinSimple的FC柱子（5cmxmID）进行icIEF分析。通过用pI5.85和8.4marker校准并假定线性pH梯度来确定异构体的pI。2.4.SEC-UV/FL分析通过在配备有DAD检测器和荧光检测器的WatersAllianceHPLC系统上进行SEC分析，可以对蛋白质样品中大量的荧光高级糖基化终产物（AGEs）进行表征。如结果和讨论部分所述，UV峰和/或荧光峰面积用于计算聚集体百分比和AGEs百分比。2.5.完整分子量分析重组单克隆抗体及其馏分用浓度为50mM的DTT还原15分钟。然后将样品用LC－MS分析（ThermoExactivePlusOrbitrap质谱仪和安捷伦Infinity二元UHPLC系统）。MS原始数据使用ProteinDeconvolution3.0（ThermoFisherScientific）处理。根据非糖化和糖化物质的峰强度计算糖化百分比：非糖化蛋白质（I0），一个糖化的蛋白质（I1），2个糖化的蛋白质（I2）……具有n个糖基化的蛋白质（In）。使用以下公式（加权平均值）计算糖基化百分比：糖化％=*（I1*1+I2*2+..+In*n）/(I0+I1+I2+..+In)2.6.LC–MS/MS肽图分析将重组单克隆抗体及其异构体酶切消化。通过LC-MS系统（Agilent1RapidResolutionUPLC+ThermoLTQOrbitrapDiscovery）分析样品。在-0m/z的MS1扫描范围内检测到了肽段，并且在阳离子模式下分析了MS/MS碎片化。3.结果与讨论由于电荷异构体涉及的分子修饰非常多，因此表征单克隆抗体的电荷变体具有挑战性。这项研究利用高分辨率FFE分离技术与先进的质谱技术相结合，能够详细鉴定抗体酸性异构体中的位点特异性修饰。单克隆抗体通过FFE分离，然后纯化和鉴定，这项研究的工作流程如图1所示。酸性馏分通过FFE制备，并使用ProteinA柱纯化。这些馏分中的电荷变体通过一整套套分析方法进行了表征包括icIEF分析、SECUV/荧光、基于MS的完整分子量分析和肽图。图1，FFE制备分离＋多手段分析流程图3.1.IEF-FFE分离结果分析通过FFE收集的组分通过蛋白质A色谱法进行纯化，以去除馏分中存在的甲基纤维素，尿素和两性电解质。高浓度的尿素会干扰ProteinA的捕获，但是在用水以1：4稀释后，尿素的浓度足够低，可以执行有效的ProteinA纯化。纯化后，将样品浓缩并更换缓冲液，以确保样品适合表征。从蛋白A捕获步骤中回收率很高（90％），但是由于与浓缩步骤相关的样品损失，总回收率要低得多（?60％）。首先通过icIEF分析样品，以评估FFE分馏的质量并确定每个馏分中存在的电荷异构体。基于它们在特定电荷异构体中的富集，选择用于进一步分析的FFE馏分。图2显示了用于分析抗体的FFE馏分以及相应的馏分和原样品的icIEF谱图。原样品的icIEF谱图可分为8个区域：5个酸性峰（A1-A5），2个碱性峰（B1和B2）和1个主峰。pI差异≥0.1的异构体得到很好的分辨，pI差异≥0.05的异构体被选择性富集。有可能获得高度纯化富集的A4，A5和主峰中高度富集（75％）的馏分。FFE分馏无法将A3与A2或A1与主峰分离。然而，获得了包含更高比例的这些酸性峰的馏分。馏分中每个区域的相对丰度表明，较早的馏分包含更多的酸性异构体。这些馏分被标记为馏分1-5。最丰富的馏分5被认为是未修饰的主要异构体，即主峰，而馏分1-4则被指定为酸性变体。图2，icIEF分析FFE收集的馏分。上图：mAb1起始原料icIEF谱中鉴定出的五个酸性变异区。下图：通过FFE纯化的馏分的icIEF图。通过icIEF确定所有馏分（Fr1=馏分1，Fr2=馏分2等）中每个变体的相对丰度。A5=酸性变体5;A4＝酸性变体4..
3.2.基于LC–MS的完整分子量分析糖基化是一种非酶促的翻译后修饰，可导致在蛋白质上赖氨酸侧链的胺基上加糖。在CHO细胞中重组产生的治疗性mAb在细胞培养过程中暴露于还原糖中，并容易发生糖基化反应。蛋白质糖基化修饰发生在赖氨酸侧链的正电荷胺基上。胺基和还原糖之间的反应形成共价键合的酮胺，并产生更多酸性蛋白质。通过LC-MS对本研究中使用的抗体进行完整的分子质量分析，检测到糖基化修饰。解卷积的质谱图显示出带有一系列+Da质量加成的峰，这代表了不同的糖基化程度。完整的质量结果显示，与主峰和起始原料相比，酸性组分中的糖基化水平增加。分析得出的糖基化定量结果汇总在表1中。馏分5（主峰）的糖基化水平7.2％为最低，而起始原料的糖基化率为23.3％水平。酸性馏分4、3、2和1的糖基化水平较高，分别约为35.3％，74.6％，.6％和.7％。结果表明糖基化修饰在酸性组分中高度富集。3.3.SECUV/FL分析聚集体和糖基化终产物高级糖基化终产物（AGEs）是一组复杂且异质的化合物，其中相当一部分是荧光的，而另一些则是非荧光的。交联和发荧光的AGEs部分为棕色，是通过还原糖与蛋白质的氨基反应以非酶促方式形成的，从而引发一系列复杂的重排和不可逆交联的脱水现象。荧光AGEs可以在大约nm附近激发并在nm处发射荧光时被检测到。本研究开发了SEC-UV/FL方法来同时量化荧光AGEs的聚集和丰度。在SEC分离后，通过nm的紫外和Exnm/Emnm的荧光进行顺序检测。通过SEC-UV/FL分析酸性馏分和主峰馏分以及起始原料。通过UV检测每个样品中蛋白质聚集的相对丰度。同时，将每个样品中蛋白质荧光信号的总峰面积除以样品相应的UV信号的总峰面积，然后与参考标准品（起始原料）的FL／UV比归一化分析。该归一化的FL／UV结果用于确定每个样品中总荧光AGEs的相对百分比。定量结果总结在表2中。表2中的酸性馏分（馏分1-4中的2.4％-4.4％）和主峰馏分（馏分5中的2.5％）的总聚集数据百分比显示，与原料药样品（起始时为1.3％）相比，聚集水平提高了。这可能表明这些组分中的聚集体可能是在SEC分析之前的样品制备和处理过程中引入的。表2中的AGEs数据表明，AGEs富含酸性组分，其AGEs含量在酸性组分中最大（组分1为％），在主峰组分中最小（组分22％）。结果表明，AGE修饰在酸性组分中富集。3.4.肽图分析通过Lys-C肽图分析各个组分和起始原料，以进一步鉴定这些组分中存在的主要修饰种类，结果总结在表3中确定的修饰包括高级糖基化终产物（AGEs）、蛋氨酸／色氨酸／组氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺、赖氨酸糖基化、羧甲基修饰赖氨酸和甘氨酸的天冬氨酸取代。图3，FFE各组分的修饰类型分析
3.4.1.蛋氨酸／色氨酸／组氨酸氧化甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸氧化在酸性异构体组分中富集。结果表明，与主峰馏分相比，酸性馏分在三个位置（Met95，Met，Met）的氧化水平略高。尽管在样品制备过程中可能已经部分引入了总氧化水平，但氧化水平与馏分酸度的增加存在明显的正相关性。与蛋氨酸氧化不同，该结果表明色氨酸氧化趋向于在靠近主峰的酸性组分3和4中更高。组氨酸也可被氧化并经历降解途径以产生许多产物。组氨酸氧化的降解物之一是天冬氨酸。His（6.04）和Asp（3.9）侧链的pKa的差异使修饰的蛋白质富含酸性物质，这与分析酸性部分的实验结果是一致的。确实证实了由His在重链上氧化导致的天冬氨酸形成。此类修饰的串联质谱如图4所示。图4:未修饰的Lys-C肽在m/z.90（上图）和His/Asp修饰在m/z.29（下图）上的串联质谱。红色突出显示的修饰位点显示了His（-22Da质量位移）在Asp残基上的定位，这已由b和y碎片离子证实。
3.4.2.赖氨酸修饰:糖基化和羧甲基修饰(CML)酸性馏分中含量较高的糖基化修饰是由于对碱性赖氨酸残基的修饰，从而改变了蛋白质侧链的酸性。已知它们可以在氧化应激条件下进一步反应形成高级糖基化终产物（AGEs）。如3.3中所述，许多AGE物种的荧光特性允许对其含量进行相对定量。部分AGE可以是非荧光修饰的羧甲基赖氨酸（CML）。在酸性部分的肽图分析中鉴定出更高水平的CML修饰而在主峰部分中则无法检测到。酸性部分似乎富含赖氨酸糖化水平，而在主峰部分却观察到非常低或不可检测的水平，这与SEC-UV/FL分析和完整质量分析的结果一致。如上所述，由于赖氨酸侧链残基的正电荷被中和，糖基化修饰导致形成酸性物质。3.4.3.脱氨基天冬酰胺（Asn）残基的脱酰胺作用是酸性物种中鉴定出的主要修饰之一。Asn残基的酰胺基可水解为游离羧酸（Asp），从而导致蛋白质电荷的改变和酸性物质的形成。如图3所示，发现酸性异构体组分中，多个位点的脱酰胺水平均高度富集。重链中的Asn和Asn，也称为“PENNY”肽，很容易脱酰胺。将脱酰胺水平定量为两个残基的总和。Asn和Asn的脱酰胺水平显示出与Asn相同的趋势，并且在酸性馏分中高度富集，而在主峰馏分中却非常低。3.4.4.碱基错配导致的氨基酸取代重组蛋白中的氨基酸取代是由转录过程中的DNA/mRNA错配，翻译过程中的密码子-反密码子错配或tRNA错带引起的。据报道，最常见的碱基错配是G-A，对应于翻译过程中G（mRNA)/U（tRNA）碱基对错配he翻译和转录过程中的G/U错配以及翻译过程中摆动位置的C/U和/或U/U错配是在营养平衡的条件下重组以及天然蛋白中氨基酸错配的关键原因。在这项研究中，通过Lys-C肽图分析发现许多Gly残基处发生了Asp取代。此修饰的串联质谱如图5所示。此修饰还导致形成酸性物质。在最酸性部分（馏分1）中测得的氨基酸取代水平最高为0.7％。从主峰到酸峰，取代显示增加趋势，并且在主峰部分中以不可检测的水平存在。为了进一步确认Asp取代，进行了Asp-N肽图实验。由Asp取代Gly的修饰肽应易于通过Asp-N酶切来裂解，因为酶会裂解N-天冬氨酸残基的肽键。通过Asp-N图谱结果鉴定了具有Asp/Gly取代的肽，证实了修饰位点的存在，且此类取代在酸性组分中有更高的水平。该发现与Lys-C肽图的结果一致。图5:未修饰的Lys-C肽图（上），发生Asp取代Gly的肽图（下）。以红色突出显示的修饰位点，显示Gly（+58Da质量位移）在Asp残基上的定位，这已通过b和y碎片离子证实。4.总结这项研究描述了通过使用FFE分离富集并鉴定单克隆抗体的酸性变体。制备型FFE技术允许对蛋白样品进行基于等电点的高分辨率连续液相分离。FFE可以根据等电点的不同来分离电荷变体，进而可以通过多种分析方法进行全面表征。icIEF分析证实了表征前馏分的归属和纯度。完整的分子量分析表明，糖化修饰在酸性部分中高度富集。通过SEC-UV/FL方法对高级糖基化终产物进行了定量。详细的肽图分析表明，与主峰和起始原料相比，酸性组分富含高级糖基化终产物（AGEs）、蛋氨酸／色氨酸／组氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺、赖氨酸糖化、赖氨酸羧甲基化和甘氨酸的天冬氨酸取代……总之，酸性变体以非常不均一的形式存在，并解释了各种低水平的修饰。本研究中使用的工作流程可轻松应用于电荷变异体的表征和鉴定，以支持生物制药过程开发和结构活性关系研究。关于FFE自由流电泳（FFE）是一种高分辨率的电荷异构体分离制备工具，在达到icIEF的分辨率的同时，单次实验分离量可以达到mg蛋白。整个分离过程在液体中进行以便进行下一步的溶剂交换，且保留蛋白的天然构象。分离的异构体可以进行进一步的结构或生物学活性研究。自由流电泳的工作原理自由流电泳的分离单元（可以对应色谱法中的色谱柱）为separationchamber，为两块10cm*50cm（W＊L）惰性板的夹层（夹层厚度um），本质为一个腔体。当分离工作buffer（有效物质为两性电解质）从一端往另一端流动的同时，在流动方向的两侧加上电压，在流动方向的垂直方向形成pH梯度。待分离物质以恒的定浓度和流速从buffer流入端注入separationchamber，一方面在电压和pH梯度的作用下等电聚焦，另一方面被buffer带动向出口端流动。当待分离样品从出口端流出时，等电聚焦已经完成。出口端（10cm＊um狭缝）被等分为96份，连接96通道，对应96孔板。相应的待分离样本在separationchamber中完成了分离，通过96通道流入96孔板。接下来只需要检测96孔板，回收对应孔中的组分，即可对电荷异构体进行深入的表征了。电荷异质性分析与表征全新解决方案
如前文所述，icIEF方法具有快速、易用、分辨率高等优点，自由流电泳FFE在达到icIEF分辨率的同时，可以大规模连续制备电荷异构体，因此，针对电荷异构体的深度研究，可以采取全新的解决方案：使用icIEF方法进行电荷异质性的分析和放行，如果需要深度质量研究，采用FFE制备各个组分。
如果您对文中所描述的自由流电泳感兴趣，
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