将成人牙髓中提取的人干细胞（由S.Gronthos，NIH，贝塞达斯，美国提供）培养在GibcoBRL生命科技公司（苏格兰佩斯利）的1/8改良的Eagle’s培养基中，加入20%FCS，2mML-谷氨酰胺，μML-抗坏血酸-2-磷酸酯，μM青霉素和μg/ml链霉素在5％CO2和37℃下在25ml和75ml细胞培养物中的溶液（Greiner，Frickenhausen，德国）。
处理细胞进行实验，并在37℃用0.25％胰蛋白酶，5mM葡萄糖，0.05％EDTA的PBS溶液培养5分钟。从培养基底部分离后，将细胞在细胞室（MiniCeM，JenLabGmbH，Jena，德国）中进行激光显微镜检查。之前在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞上进行过比较研究，这些细胞在许多国际实验室都作为参考细胞。
将CHO细胞在含有10％FCS，L-谷氨酰胺和青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素混合物的DulbeccosHAM-F12培养基（GibcoBRL）中并且是5％CO2和37℃下孵育。胰蛋白酶化与干细胞相对应。个别细胞在外部玻璃窗上有特殊的菱形雕刻。在检测细胞损伤的情况下，利用相衬技术可以很容易地定位这些雕刻。
激光显微镜
80MHzTi:Sa激光，MaiTai（0spectral-physics,MountainView,USA）在近红外光谱（NIR）中应用于飞秒激光显微术。
使用测量仪器Fieldmaster（Coherent，SantaClara，USA）和测量头LM2确定显微镜入口和物镜平面（样品的功率）处的激光功率，并且在必要时通过灰色滤光片进行变化。
所测量的值是在提交的协议中被指定的。与空气相比，这种校正来自有限的测量区域并且改变了介质中的辐射条件。激光显微镜是通过改进的LSM（ZEISS，Jena，德国）用40x/1.3油浸物镜实现的。激光扫描时间t=16s的显微镜扫描方式×用于细胞照射。
这些细胞在同一焦点平面上被扫描了10次。这些实验是在nm的中心波长处实现的。在辐照后，细胞被转移到培养箱中，以保证进一步生长、细胞分裂和修复过程的最佳条件。
脉冲拉伸装置，产生和测量fs脉冲
为了将样品的脉冲持续时间提高到fs，在显微镜前的光路中实现了脉冲链路单元。该装置由镀膜反射镜和两个平行排列的镀金光栅组成，光栅常数为行/毫米。第二个光栅被安装在一个具有微米精度的机动台面上。脉冲宽度随光栅距离的变化而变化。激光束通过第一个光栅接收到空间色散，在第二个光栅处进行补偿（图1）。
脉冲持续时间最初是在MINI（APE，柏林，德国）自动相机的激光出口处用中心发射波长为88fs，在nm处为80fs，在nm处为91fs来确定的，假定了高斯函数。一般来说，由于发散光束的存在，被测物体焦平面的测量并通过酶促反应转化成强绿色荧光钙*绿素，它不能通过完整的膜。乙炔-同型二聚体-D1是一种红色荧光，即所谓的死细胞染色剂，它只能穿透受损的细胞膜，并通过与DNA结合而显著增强。在辐照后，生命/死亡试剂盒被孵育5.5小时。用双光子激发来实现荧光。
光诱导的ROS形成的验证
ROS的形成是根据Hockberger等的方法通过双光子激发确认的原位膜的透水荧光团dihydroflurescein（DHF）。
首先，将细胞与标记物（10μM，Fluka，Germany）一起温育，并在15分钟后对其辐照。只有一种ROI（感兴趣的区域）受到辐射。周围的细胞被用作对照。照射后，以4mW的低功率实现全帧扫描，以便观察效果。
结果
对脉冲展宽单元进行调整，使每个激光波长的焦点的脉冲持续时间为fs±50fs。将单个DPSC细胞扫描10倍，并测定其与未辐照的周围细胞的效果。另外，使用CHO细胞完成比较实验。为了尽可能地抑制细胞间通讯，选择了广泛分布的细胞或细胞簇。在扫描过程中，检测到传输信号，并将其作为图像显示在监视器上。共有个细胞进行形态学检查和生命/死亡试验，50个细胞接受ROS检查。将结果与先前的脉冲宽度为fs的结果进行了比较。
形态改变
所谓的黑点是由特定的照射功率参数在细胞中明显的肉芽形成的位置产生的。激光功率逐渐增加2mW，以测量出现第一次激光诱导形态变化的阈值（表1）。在这些条件和最佳聚焦条件下，DPSC细胞出现黑点的最小功率为20mW，CHO细胞为22mW（表2）。在26mW的功率下，30％的DPSC细胞和仅15％的CHO细胞表现出这些形态变化。激光诱导的黑点细胞通常在接下来的5小时内出现形态学变化，从而显示出光损伤效应。
生命/死亡测试
首先，用不同的功率参数（4mW，12mW，16mW，20mW和32mW）照射DPSC细胞。将辐照细胞标记，在5.5小时后用生命-/死亡试剂盒孵育，孵育1小时后测试其荧光行为。在20mW的照射下，69个DPSC细胞中的64个显示出绿色的细胞质荧光，而在5个DPSC细胞中观察到红色荧光（表3）。这相当于7％的伤害。
当功率提高到26mW时，已经有35％受到致命的影响。然而，所有的CHO细胞都耐受20mW的功率，其中15％在功率为36mW时染色（表4和图2）。与较短脉冲宽度的实验相比较，其中已经有73％的DPSC细胞在20mW的功率下被损坏，这表明细胞更耐受较长的fs的脉冲宽度。
验证激光诱导形成的ROS（活性氧）
辐照显示，在平均功率低于35mW的情况下，没有检测到DHF信号。从图3（a和b的上部）可以看出，在上部辐照的细胞中，在37mW的较高功率下检测到ROS信号。在较低的未照射的细胞中也发生弱的荧光信号。然而，该细胞通过膜接触与辐照细胞连接。如果功率只是微不足道地增加，其影响就会变得更加明显。在图3c中，被照射的细胞显示出明显更高的强度。这种效应也与辐照细胞的大量荧光相结合（图3f）。因此，在fs的脉冲持续时间的照射期间形成破坏性的氧自由基。与fs实验相比，平均功率明显较高是实现可检测的ROS形成所必需的。
结论
DPSC在被描述的辐照条件下，其脉冲宽度为fs，比fs的脉冲宽度短，对辐照的敏感性较低。平均功率参数为20mW，在辐照后6小时内，高达10%的细胞会受到致命的影响。平均功率为26mW时，仍有三分之二的细胞存活。在较短的脉冲宽度下，所有细胞都将受到致命的影响。在更高的脉冲宽度和恒定的脉冲能量下观察到的较低的灵敏度与在nm的照射波长下对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的早期研究的结果一致。在这些早期的研究中，得出的结论是损伤是受双光子效应影响的，因此可以根据公式来预测损伤效应E。
DPSC在被描述的辐照条件下，其脉冲宽度为fs，比fs的脉冲宽度短，对辐照的敏感性较低。平均功率参数为20mW，在辐照后6小时内，高达10%的细胞会受到致命的影响。平均功率为26mW时，仍有三分之二的细胞存活。在较短的脉冲宽度下，所有细胞都将受到致命的影响。
在更高的脉冲宽度和恒定的脉冲能量下观察到的较低的灵敏度与在nm的照射波长下对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的早期研究的结果一致。在这些早期的研究中，得出的结论是损伤是受双光子效应影响的，因此可以根据公式来预测损伤效应E。
E~P2/twithP：平均激光功率和t:脉冲宽度与此相比，由于F=fs/fs=4的脉冲宽度增加，因此，为了达到同样的破坏性效果，需要增加因子S=1.7到2的功率。
这个关系不能完全根据所提供的数据来确定，但可以假定S1.25的因子，因为已经有7％的DPSC细胞死亡，平均功率为16mW，脉冲持续时间为fs，但在fs时需要20mW来达到同样的效果。
DPSC细胞在fs的脉冲宽度比CHO细胞更敏感。在26mW激光功率的暴露下，与35％的DPSC细胞相比，只有15％的CHO细胞受损。检测到的ROS形成表明了光化学损伤过程。
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