前言
首先搞科研必须要有科研的心态。细心是干任何事所必须具有的，对于科研更是至关重要，细节决定了成败；信心也是要具有的，实验失败是再平常不过的事了，失败一定不要气馁，从头分析，设计对照，逐一排除各项因素，找出问题的所在，不断地改进，相信自己最终会成功的。恒心也是对于科研至关重要的，一项课题不是一天两天完成的，需要日复一日的去做，有时候就是一个实验操作要重复的做，因此只有拥有了恒心才能持之以恒的向最后的成功迈进。最后就是绝心，绝心就是指在进行任何实验操作时要持有绝对的的态度，不可有模棱两可，差不多的态度。这些是搞科研所必须具有的素质。用一句经典的话就是：复杂的事情简单做，简单的事情认真做，认真做的事情重复做，重复做的事情创造性做！
其次要掌握一定的方法。实验之前必须进行分析，制定实验计划，分析影响因素。任何实验基本上会经历以下过程：
一、查阅文献。查阅文献时先查阅中文相关文献，然后对相关内容有所了解后查阅外文文查阅外文文献可以使用图书馆数据库、NCBI中pumbed数据库、谷歌学术搜索等。
二、设计流程及时间表。对整个实验流程事先必须要熟悉，以便根据自己的时间进行相关的时间安排，做到不急不躁，稳中求进。尤其不要忽视试剂用具准备及样品处理的时间。
三、试剂及用具的准备及样品的处理。材料用具准备的前提是对实验的步骤充分了解，了解以后据直准备。对于分子生物学相关的实验基本都需要无菌的试剂及用具，因此需要事先进行相关的灭菌处理。对于绝大多数试验的第一步都需要样品的相关处理，然后才能进行之后的相关实验操作。样品处理尤其是对某条件的多梯度处理时，一定要保证其他条件的一致性，方可具有比较性，因此处理样品时要充分考虑如何控制其他条件的一致性。准备工作是整个实验的核心，不可忽视，确保第一步必须要走好！
四、实验设计及可能影响的因素。不同的样品、不同的条件、不同的地方因此也决定了实验的不同性。运用哲学说就是具体问题具体分析，共性中有个性。因此对于某个实验操作不可完全照搬他人的实验步骤，应根据自己的实验进行相关的优化。另外每一步实验操作的的原理必须要搞懂，这是优化实验步骤和寻找问题所在的前提。
最后不要犯一些小的错误，要养成一些科研习惯。比如标记的习惯，无论个数少还是多都要按照标记的规则进行标记，尤其配制试剂时；做笔记的习惯，无论是达到了预期的结果还是失败的结果都应做好笔记，这是以后反思的重要材料来源；还有就是正常工作的习惯，一时结果不好，不要挑灯夜做，这样更不会有什么效果，错误不断，只有休息好了才能做好实验。
本文主要详细介绍了一些常规实验操作步骤及注意事项以及部分生物信息学知识等内容，其内容都是编者所在实验室常用的步骤以及编者在实验过程中所遇问题的总结，特别适合于初学者的学习。本书参考了相关的文献及程娇娇、曹京、王桂栾、毛瑞峰等的毕业论文以及网络论坛、fermentas公司操作注意事项（
总之琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。
2、琼脂糖凝胶电泳原理
DNA分子在常规的电泳缓冲液（高于等电点的pH溶液）中5’磷酸的氢离子解离被中和，而只剩磷酸根离子，故带负电，因而在电场中向正极移动（电荷效应）。又由于琼脂糖凝胶具有分子筛效应，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型。因此琼脂糖凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子，如质粒三种构型。
在构型相同条件下，具有不同分子量（碱基对）的DNA片段迁移速度不一样，DNA片段迁移距离与分子量（碱基对）的对数成反比，所以可以通过已知大小的标准物移动的距离与未知线性DNA片段的移动距离进行比较，便可测出未知DNA片段的大小。同时由于电荷效应存在，因此在测定DNA分子大小时，可以提高凝胶的浓度和降低电压，减少电荷效应，增强分子筛效应而提高测量准确性及电泳的分辨率。
3、明白了上述原理那看图吧！
（1）线性染色体DNA
其广泛分布于动植物细胞中，为染色体的主要成分，多呈现双螺形。其电泳结果多呈现一条带，接近点样孔。若未用RNAase处理，则最前方很亮的为RNA。
（2）质粒DNA
一般提取的质粒有3种构型：
1、超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)，
2、开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(opencircularDNA，简称ocDNA)，
3、线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链发生断裂(linearDNA，简称LDNA)。
由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。通常提取的质粒DNA呈现两种构型，即电泳后呈现两条或一条带。
（3）总RNA
提取的总RNA一般呈现三条带，由于rRNA在细胞中含量最高，且提取的rRNA的质量可以反映总RNA提取的质量，故可以根据rRNA(真核生物)的三种形式5S,18S,28S的质量进行判断。如果28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。
注：
S为沉降系数（sedimentationcoefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有个核苷酸，16S含有个核苷酸，而23S含有个核苷酸。而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约、、和个核苷酸。rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。
二、设备与试剂。
1、电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。
电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。
电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。
垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm14cm，厚度为1mm～2?mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。
2、试剂。DNA要游泳，则必须要有水，用的水那是什么呢？比较常用就是这两种了：TAE（Tris/Acetic/EDTA）和TBE(Tris/Borate/EDTA)
1）TAE
配制：一般配制50×的母液，使用时将其稀释至1×。
特点：TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
应用：大片段核酸分子分离，琼脂糖凝胶电泳DNA的回收，酶切检测，PCR反应。
2）TBE
配制：常配制成5×的母液，使用时稀释至0.5×使用（配制成5×的可以放置较长时间而不形成沉淀）。
特点：高浓度储存液易发生沉淀，故母液的配制量一次不宜过多，一旦配出后应尽快用完。
应用：对于一般的仅做检测的电泳常用此缓冲液，如DNA、质粒、RNA提取后的检测。
3）TAE与TBE的区别
TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存。采用TAE长时间电泳发热大，迁移速度较快，利于长片段的电泳。
TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀。其对小于1kb的片段分离效果较好，但因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，而且硼酸盐离子有可能影响后续的酶促反应，因此回收电泳一般不推荐TBE电泳。
4）上样缓冲液（LoadingBuffer）。
DNA分子在电泳中如何让他停下来，不让它从我们的凝胶中跑出去，这时就要实时监控了！除了实时监控，还必须让他沉下去，才能泳动！哈哈，用啥呢？常用的有6×的和10×的loadingbuffer了，一般在购买的酶制剂中均带有。下面小编就详细介绍了！
作用：第一，上样缓冲液具有指示剂溴酚蓝和二甲苯酚，它们起到指示的作用，显示电泳的进程，以便适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，10×LoadingBuffer是加有SDS的。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。
使用上：两种缓冲液均可用于DNA和RNA电泳，但更有所侧重。6×LoadingBuffer，向电泳样品溶液中加入1/6量即可进行凝胶电泳，常用于DNA电泳。10×LoadingBuffer是用于琼脂糖凝胶电泳的10倍浓度的核酸样品用，常用于RNA凝胶电泳。由于该制品中含有SDS，容易起沫，故点样时应注意。此外其可以用来停止各种酶促反应。向酶促反应液中加入1/10体积的本制品，即可停止反应。
指示剂：10×loadingbuffer中仅有色素溴酚蓝（BromophenolBlue)一种染料（浓度0.05%）；6Xloadingbuffer中含色素溴酚蓝（BromophenolBlue)、二甲苯腈蓝FF（XyleneCyanolFF)两种染料（浓度都是0.05%），溴酚蓝在琼脂糖凝胶（1%）中约与bp的双链线状DNA的迁移速度相同，而二甲苯腈蓝FF则与bp的双链线状DNA的迁移速度相等（不同浓度凝胶指示剂位置不同）
三、具体步骤
1、1%琼脂糖凝胶电泳胶液的制备：称取0.2g琼脂糖，置于三角瓶中，加入20ml1×TAE缓冲液，置于微波炉中30s+10s+10s加热至琼脂溶解
加热溶解胶时待胶中起泡即可。
2、胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晾干，放入制胶模具中，向冷却至65℃（不烫手）左右的琼脂糖凝胶中加入1ulGoldview后倒入有机玻璃内并在固定位置插入梳子。Goldview可以不按说明书要求加，如20ml琼脂糖加0.5ul就可以了，尤其用于回收的胶，减少goldview的量可以减少对DNA的损伤。
3、应在室温下慢慢凝固，形成均匀的孔洞，若在冰上使其迅速凝固，形成的孔洞不均匀，影响电泳
4、表面形成均匀的胶层，室温静置30min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，将胶放入装有缓冲液的电泳槽中
5、加样：取5ul基因组DNA与1.2ul6×LoadingBuffer混匀后用移液枪点样，每加完一个样，换一个加样枪头，最后再点5ul的Marker0
1）加样时用两只手操作，以防晃动。
2）若枪头前有气泡，应小心的将样品推至枪头的最尖端。
3）注意枪头的尖端不可过深的插入孔道，以免将胶孔刺破。
4）DNAmarker，每一条带都是具有固定浓度（参见说明书），电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。5、2、4、6等，另外此方法也是判断紫外分光光度仪测量核酸浓度准确性的一个依据。
6、电泳：一般在80-v电压下电泳，电泳直至溴酚蓝指示剂到胶的三分之二处停止电泳。
7、观察、拍照：将其放在紫外反射投射仪中观察，并在凝胶成像仪中拍摄电泳图片。
四、注意事项。
1、胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果（若出现气泡，可用带枪头的枪将气泡戳破）。
2、有时需要大的上样孔,可用胶带把几个相邻的梳齿粘在一起,这种情况下,尽量让胶液冷一些再倒胶。
3、如果只是为了看结果，不需要拍照或回收,同一块胶可重复用1-3次.
4、用保鲜膜包裹凝胶后放入4度冰箱，或将凝胶浸泡在缓冲液中可保存数天。
5、若点样后胶空中的样品迅速消失，则证明胶孔具有漏洞，原因可能凝固时间太短（凝固时间至少30min）。
6、电泳缓冲液可以重复利用但必须能够保持电泳所需的一定的离子强度和pH，否则应及时更新电泳缓冲液（尤其在恒压条件下，电流过大时）。
7、为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀后再用。
8、保证缓冲液淹过胶的上端1-2mm。缓冲液过多，电流则会从胶上部通过而不会通过凝胶，这样会增加分离核酸所需的时间。
9、薄的凝胶电泳结果要好于厚凝胶，但易碎应小心操作
10、一般配1×TAE时不够严格时,如浓度过大,电流就会增大.如果配得较稀,则电流会减小.另外电压与电流的比例还会受电泳槽的长宽比的影响，如果电泳槽宽固定，长度增加，则电流与电压的比会降低．
11、注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低被电击的可能性。
12、电泳至溴酚蓝至凝胶的三分之二时，即可停止电泳（实际过程中，跑至二分之一略多一点即可停止电泳）。
五、结果分析
1、DNA电泳的MARKER为什么是扭曲的？电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。另外上样时等样品自然沉降后再加电压。
2、电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
3、小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率，上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
4、凝胶未完全凝固，点样孔未固定好，导致条带不规则。
5、加样孔发亮：其中最主要的是非蛋白质/非核酸类的大分子杂质(如多糖、多酚)的残留以及蛋白质和核酸的同步残留。另外，样品使用过量，也是一个重要原因。
6、胶的厚度增大会导致电压过大
六、电泳胶图自动编号软件
1．前言
笔者一直是做数据分析的，基本没跑过胶，前两天为了实验需要，做了几板胶图。但是胶图读带数胶孔的时候，我有些强迫症，每次数到一半就数乱了还要再重新数，一个胶图要重数好几次，这让我抓狂了。于是我决心写个程序来自动把编号添加到胶图上，方便读带。经过两天的努力写了一个自动加编号的程序，结果如下图，效果还是很好，数字位置标记很准确，再也不用担心胶图读带了。
虽然说自动，但是需要用鼠标点几下，是半自动的。我也想过通过模式识别，识别出胶孔，但是很难，而且胶图的情况复杂，全自动不现实。
程序是用R语言写的，需要使用者稍微有点R语言基础。本文就不介绍R语言程序的安装了。
2．安装
使用前先将add_num文件夹下所有内容下载到本地（