构建一个质粒需要多久？
答曰：顺利的话从头到尾也不会超过一周。
但是在“顺利”之前要经历些什么是只有做过的人才知道的暗无天日想几个月前，刚开始构建质粒，当时以为容易的很，于是单枪匹马雄赳赳气昂昂的进行，从引物设计、PCR扩增目的基因、酶切、连接、转化到最后挑单克隆提质粒去测序，到不行直到.....测序结果出来，这TM全是假阳性啊，我呵呵了感觉心脏骤停，于是之后的几个月开始排除各种问题，在连接不上和假阳性的边缘旋转跳跃卒……最后的最后，排除重重大BUG、小细节，终于在两周内把我的十几个质粒构建好，主要用的还是双酶切和同源重组的方法，下面是实验室小菜鸟是如何作死之双酶切法篇。
引物设计引物设计前，我们需要了解质粒的序列和图谱。以pLVX-Puro为例，我们最需要了解的有：酶切位点、标签以及抗性。1、酶切位点选择启动子后面的MCS区的酶切位点，需要确认的有（1）酶切位点在质粒上是单酶切.（2）在目的基因上不能有所选择的酶切位点.（3）为了避免载体自连要确保两个酶切位点产生的黏性末端不能互补。（4）两个酶切位点不能离的太近，至少不小于5bp，隔得远一点质粒酶切的时候效果更好。如图质粒我选择的就是实验室最常用的Xhol和EcoRI两个酶切位点。2、根据需要选择带各类标签的载体。如果载体上不带蛋白标签，并且你需要的标签比较小（比如HAtag，只有十几bp）可以直接通过引物把标签连到载体上。3、抗性，主要有氨苄抗性和卡那抗性，小心别用错抗生素啦，不然当然啥也长不出来啦了解了这些之后，可以设计引物了，根据个人喜好选择一款引物设计软件，嗯，我用的是VectorNTI。设计引物时，在目的基因引物的5’端加上酶切位点，重头戏来了！！！！你以为加上酶切位点就完事儿了吗？知道保护碱基怎么加要加几个够用不？不加保护碱基后果很严重！做个比喻，如果你的目的基因是根筷子，那么从中间掰肯定容易掰断，但是你从一端掰就难的多，所以加保护碱基的目的就是为了让限制酶工作的时候“省力”。事实上，关于要加几个保护碱基才能省力，查查你限制酶