有没有感觉界面很简单，同时我们可以点击左下角的红色图标，将其转换为中文。
下面以人TP53基因为例介绍。从NCBI上下载TP53的编码区（CDS）区后，点击NewDNAFile，将序列复制进对话框，如下图所示：
因为导入的序列是线性而非环状的，因此默认Linear,在FileName里面可以输入我们的基因名TP53，点击OK即可，界面如下：
最下面有工具栏选项Map(图谱)即是当前所展示的界面，点击sequence则会显示其序列及其所编码的氨基酸，如下图：
Enzymes是酶切位点设置，点击进去界面如下：
在这里，点击Noncutters，就是该序列不被哪些酶所识别，这是在构建质粒时需要考虑的，这里将以TP53基因克隆进pEGFP-C1载体为例，来讲解酶切位点的选择以及引物的设计。（本次笔者分别讲解传统的构建质粒方法，以及目前常用的同源重组的方法。）
首先从snapgene软件中选择pEGFP-C1载体，选择File→Import→Snapgeneonlinesequences，界面如下，在其中搜索pEGFP-C1：
接着点击Import,即可得到其载体信息：
在最右边的面板，是对该载体的一些相关描述，可以勾选DescriptionPanel，使其显示或者隐藏。
对目的基因TP53进行酶切序列分析，看其不能被哪些酶切割，而载体可以被这些酶识别切割。
接着，选择Enzymes→HideEnzymes即可将所有酶切位点隐藏，点击Enzymes→ChooseEnzymes，在搜索框检索BamHI和EcoRI，点击ok即可得到下图（只要是载体上有该酶切位点但序列里面没有即可）。
该例中笔者就选择BamHI和EcoRI为酶切位点，对载体进行双酶切。利用软件将TP53基因插入该载体，由于氨基酸是由密码子编码的，一个密码子由3个碱基构成，在构建载体时需要考虑目的基因插入载体后是否会发生移码，如果发生移码需要在设计引物时加入适当个数的保护碱基。
EcoRI识别的序列为GAATTC，且TCT编码一个氨基酸（S），如果直接在EcoRI所识别的序列GAATTC如下后面插入目的基因的话，会造成目的基因发生移码突变，因此，在酶切位点前后各加一个保护碱基（百度保护碱基表），GGAATTCC，然后加上设计好的引物即可，在随便一个位置插入目的基因，这里在GAATTC后面插入以模拟真实的克隆情况，在这里需要说明的时是由于EGFP具有起始密码子，因此在设计上游引物时去掉目的基因上的ATG，选择EditInsertBases，将目的序列插入即可，如下图：
选取目的基因上下游15到30个碱基，进行引物添加，先选取一段序列，如下图蓝色部分：
随后点击上方菜单栏Primers→Addprimer，出现如下界面，因为选取的是上游，所以点击TopStrand,分别出现如下界面：
在Primer选项（红色标记部分），可以对引物进行命名，在Insertions这个选项，插入氨基酸或者酶切位点，这里选择EcoRI，并且在酶切位点前后加上保护碱基，一方面是为了引物更好的与模板结合，另一方面是为了防止目的基因发生移码突变。如下图蓝色框中的红色字母即为保护碱基。接着点击最下方AddPrimertoTemplate,即可将引物添加到模板上了。
随后添加下游引物，操作与上游一样，设计好的引入如下图：
需要重点强调的是在设计上下游引物时，无论载体上的标签在C端还是N端，都需要考虑移码的问题！！！
以上是传统的质粒构建引物设计方法，接下来介绍利用同源重组构建载体时设计引物的方法，依旧以TP53基因为例，简单说一下同源重组的原理：在设计引物时，在引物的前面加上一段与载体同源的序列，即同源臂。随后利用RCR的方法将这段同源区段加入目的基因两端，在同源重组酶的作用下，将目标载体与目的基因进行连接。将目的基因插入到酶切位点之后，这个与上面的传统方法相同，也需要考虑移码问题，但一般将其直接插入在3的整数倍的密码子后面，这样就不需要再插入额外的碱基了。同源区选择15到25个碱基，如下图：红色标记的碱基即为载体上的序列，即同源臂：随后的操作与传统方法的步骤一样，得到的上游引物如下图：在设计下游引物时需要注意的是，EcoRI和BamHI会将其中间的序列切除，因此在设计下游引物时，可以将目的基因终止密码子之后及BamHI之间的序列删除之后再添加同源臂，如下图紫色序列部分即为需要删除的序列：选中这段序列，点击Edit→cut，即可将这段序列删除。之后的操作与正向引物一样，得到的引物如下图：后面就可以合成引物，构建目的基因了，是不是觉得还是挺简单的。其实Snapgene还有很多功能，感兴趣的小伙伴可以自己尝试去挖掘吧。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇