Hello，大家好，上次的DNA抽提精髓会意的何如了？没有会意的同学就是DNA抽的还不够，回去再多加练习能意会了……话说正准备学习分子克隆的你花了两个小时的抽提拿到了DNA的时候是不是有些小鸡冻呢？好了，Tony告诉你这只是万里长城的第一步，本期Tony传授你口诀心法——引物设计，让你内功大增，成为分子克隆老司机指日可待。
PCR，PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应，是一种放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由年，美国科学家Mullis博导首先提出设想，年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。进入21世纪了，这项技术已经十分成熟高通量测序也是基于PCR技术的完善而诞生和发展的。
就PCR本身拿到现在来说，十分简单，无非就是模板+引物+dNTP+Buffer(Mg2+)+TaqDNAPolymerase这几样东西混在一起。甚至现在都有混合好的MIX产品，直接加入模板和引物，就可以放在PCR仪上，设定程序之后按下start，你就可以回去睡大觉去了，Soeasy！！！现阶段能否顺利拿到你感兴趣的DNA片段，只要把好两关即可，第一就是模板，也就是小编上期讲的植物基因组DNA抽提，再一个就是引物设计了。（Tony：Primer在手，片段我有~）
具体操作可以参考下面视频：
(来源：Thermo译制:Tony)
由于引物是要花钱给公司合成的，设计的好坏不但影响实验进度，而且还浪费实验室经费，同时打击自信心，所以引物设计最好是有人手把手教一下。
个人总结设计经验，主要有以下几点：
1.引物长度控制在18-22bp左右（特殊PCR除外）；
引物过短会增加非特异性结合，结果就是PCR产物会产生多条带，增加实验难度，不好判断是否是你的目的条带。引物过长虽然增加特异性结合，但是相应退火温度上升，合成成本也会上去，所谓性价比不高（壕实验室随意~）
2.引物的GC含量尽量保持在50%-55%左右；
GC含量意味着退火温度，GC含量越高，需要的退火温度也就越高，虽然TaqDNApolymerase高温不容易变性，但是过高的退火温度势必影响酶的活性和保真性，目的条带容易产生突变，或者拖带现象~
3.引物的3’端最好有GClock保证Taq酶的准确扩增；
引物的3’端是DNApolymeras开始以模板链为模板加上dNTP的过程，3’端有了GClock之后可以增加保真性，不容易发生错配现象，同时也可以增加退火的稳定性（GC是三个氢键）~
4.引物的退火温度控制在50-55℃；
同第二条，不再赘述~
5.引物序列中最好不要有poly区域；
引物中出现poly序列给公司合成引物时容易发生错误（通常容易少）。
6.在两条引物中无论朝哪个方向，都应该避免出现连续四个或者四个以上的配对碱基；
这样可以保证不太容易引物自己直接退火配对形成引物二聚体，从而浪费引物。
7.在酶切位点5’端前面加上2-3个保护碱基
这是防止在合成引物的时候机器自身稳定性的原因，加上2-3个保护碱基之后酶切位点的碱基就不容易合成错误，从而导致后面不能被内切酶正确识别。
除了视频中提到ThermoFisher的网站，Tony推荐primerpremier5.0软件进行设计。OK，就写到这里了，欢迎大家交流讨论。今天可是满满的干货~Tony下期将介绍如何将处理高GC含量的DNA模板，两周后不见不散～
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TP线上课《抗体库展示技术实用经验和最新进展》已于6月5日开课（点击此处查看课程主要内容），由双展生物总经理CEO，泷搌（上海）生物科技有限公司总经理CEO周辰博士主讲。
TP小编整理了课程中所有疑问以及周博士的解答，供各位学员参考。
"1.6是表达低，亲和力高，应该是最好的啊。表达可以通过密码子优化，信号肽的配合解决。
A：实际上，事情比我们想象的复杂，有多种因素可以影响抗体的表达，密码子优化针对非优选密码子这个因素，但并不能解决影响表达的所有问题，有的时候氨基酸序列本身可能是影响表达的关键因素。
2.为什么不用流式分选后，采用单克隆筛选评估？
A：我们是用流式分选双阳性的单细胞，通过单细胞克隆的方式分选到96孔板，每一个孔里1个细胞，等细胞扩增，得到足够的细胞后，再做分析，就可以直接得到在CHO细胞可以高表达的高亲和力抗体。
3.老师您好！我了解到BCR是膜表达的IgD。能否直接筛选B细胞，省去做克隆或者建库过程？
A：现在有很多公司可以做单细胞克隆直接筛选B细胞。但难点是，你必须每一次都要有免疫供体，都要从供体身上取免疫组织，然后染色分选B细胞，大部分情况下，还要做B细胞扩增，其实也是非常痛苦的过程。
4.用噬菌体筛选几轮再转至哺乳动物展示系统啊？
A：我们噬菌体库的库容是4x，有效克隆在80%以上，用我们的库筛选抗体，基本两轮就能筛选到，有的抗原，筛选时不需要再扩增，直接就可以筛选到，具体筛选几轮，取决于平台和抗体库的质量，也取决于抗原的特性。
5.两次胶回收片段不会损失很多吗？
A：是的，会损失很多，就是怎么去平衡损失和最后的连接转化效率的问题。虽然你会损失一些，但除去很多杂的DNA，但可以提高连接转化效率。
6.请问其他细胞是否可以用来做哺乳动物细胞展示？
A:可以。我们选择CHO细胞，主要考虑市场上的抗体药大部分用CHO细胞生产。如果通过CHO细胞筛选到先导分子，最终决定推进到下一阶段的开发，回到CHO细胞生产，可以期待，先导抗体将保持原有的表达和亲和力特性。
7.请问连接产物的纯化也是胶回收吗?还是试剂盒呢?
A：我们使用PCRClean-up试剂盒。
8.周老师，目前你们噬菌体展示筛完以后，再克隆到哺乳动物细胞展示载体上，需要经过PCR吗？还是直接酶切连接的呢?
A：需要做PCR扩增，然后做酶切，再做连接。
9.细胞展示技术为什么要选择B细胞呢？
A：并不是细胞展示技术要选择B细胞，而是建抗体库的原材料需要B细胞，因为我们要的是抗体展示，只有B细胞才带有抗体基因。
10.周老师好，细胞展示用的跨膜区是什么呢？
A：很多跨膜序列都可以。我们用的是PDGFR的跨膜序列。
11.请问你们一次电转所用的连接产物量是多少呢？
A:没有固定的量，要看具体能纯化到多少连接产物，浓度是多少？我们做电转，一般50ul感受态细菌，加连接产物体积不超过3ul，DNA总量不超过1ug。
12.T细胞的TCR能进行细胞展示吗？针对peptide-MHC为靶点的筛选未来会有应用价值吗？
A:应该可以展示，也应该有应用价值。
13.老师怎么看待组合库抗体重轻链配对非天然的问题？
A:个人认为，天然配对的价值只在从免疫供体，比如用转基因小鼠杂交瘤技术筛选抗体，或者直接通过B细胞克隆筛选抗体时可以体现，难度和成本是需要考虑的因数。传统杂交瘤技术，如果开发抗体药，人源化改造后就不是天然配对了。抗体库展示技术筛选到的抗体，基本上都是非天然配对，但只要后续研发到位，同样可以开发出高质量的抗体药。如果有高质量（多样性和库容量）的噬菌体库和配套的筛选技术，结合细胞展示技术，通过CHO细胞筛选先导分子，大量难以预测，需要花费大量人力物力的工作就在细胞展示阶段由CHO细胞来完成，可望降低非天然配对的影响，加快抗体药的研发进程，最终提高抗体药的研发成功率。
14.库建好后怎么做库的维护呢？在后续使用过程中库的多样性会不会下降？
A：抗体库的质量取决于抗体库的多样性和库容量。库建好后，冷冻保存，使用时再解冻。相比于新鲜的抗体库，冻融后噬菌体滴度会下降50%左右。如果保存不当，10次方库，使用时可能只有9次方。噬菌体库的扩增，库容可能还会提高，但多样性的下降可能不至一个log。所以扩增后，噬菌体库材料可以很多，但是最后的结果，你可能很难拿到好的东西。
15.老师，贵公司噬菌体展示用的是M13KO7吗，细菌是哪种呢？
A:我们用的辅助噬菌体是M13KO7，细菌是TG1。
16.老师，您遇到过噬菌体文库复苏澄清的情况吗？可能原因是什么？
A:我理解您的问题是用噬菌体库侵染相匹配的细菌，摇菌后，菌液变澄清。这种情况，可以摇一管没有噬菌体侵染的细菌（不加抗菌素），如果没有侵染的菌液变浑浊，侵染的菌液变澄清，可能是细菌裂解了。
17.老师怎么看待phagedisplay出来的抗体developbility的问题?
A:我的理解，这是phagedisplay技术的特性决定的。Phagedisplay的宿主是细菌，得到的是细菌“喜欢”的蛋白，是抗体片段而不是native结构的抗体，也没有转录后修饰。到了做developbility的时候，抗体是哺乳动物细胞表达的天然结构抗体，也有转录后修饰，抗体的稳定性，溶解度，亲水疏水程度等理化性质或多或少都会有改变。就一个特定的先导抗体分子，上述这些因数，具体哪几个有影响，每个的影响程度有多大，现在也没有好的办法事先准确预测/预防。噬菌体展示-CHO细胞展示相结合的双展示技术，用噬菌体展示技术富集抗原特异性“binders”，然后让CHO细胞展示去解决这些没有办法事先预测/预防但又必须解决的问题，直接通过CHO细胞筛选高表达高亲和力的先导抗体。不能说双展示平台可以解决所有这些问题，但应该可以在相当程度上提供一个解决方案，其优势和特点在理论上是靠得住的，也得到已发表的实验结果的支持。
18.老师你好，噬菌体建库用的感受态细胞的品牌？
A:我们用的是市场上可以得到的TG1感受态细菌。
19.做Fab时，抗体重链和轻链可能存在表达量的差异，会不会出现不完全配对的情况?
A：理论上，每个噬菌体只表达一种Fab，虽然可以有多个分子，但不应该出现错配的问题，倒是有可能有表达量的差异。
20.老师你有用过ss宿主菌吗?
A：有的使用者觉得ss感受态细菌的转化效率比TG1高。TG1和ss我们都用过，比较喜欢用TG1，通过IPTG诱导可以直接用ELISA分析菌液中的特异性Fab表达。
21.老师，请问流式分选技术方案可以分享吗？
A：请看参考文献，也可以讨论。
22.有什么比较适合做哺乳动物细胞展示的流式分选仪推荐吗？
A：根据需求确定，没法一概而论。
23.老师您前面提到的电转效率是连接产物还是纯质粒呢?
A:在这个TP课讲的电转效率用的是纯化的连接产物。
24.为什么不采用Cre-lox重组系统来构建噬菌粒库？
A：这个系统我不熟悉。
25.老师，可以分享一下关于针对RNA设计对应建库用的引物比较有参考价值的文献么，谢谢！
A：设计引物的文献有很多，但就建抗体库而言，个人的体会，参考价值不是很大，因为建抗体库的引物需要结合的那一段碱基序列是一定的，几乎没有改变的余地。通过计算引物中与可变区特异性配对的那一区段碱基序列的溶解温度，我们设计的引物的融解温度在70°左右，PCR的退火温度在65°，尽可能减少非特异性结合。你也可以用热启动的酶减少非特异性扩增，不过成本比较高。
26.TG1菌株来说连接产物好像达到9次方很难，怎么增加超螺旋结构的连接产物呢？
A:我们的体会，关键是提高片段的纯度，确保片段粘性末端的完整性。
27.scFv和Fab库哪一个更好？
A：用于CAR-T项目，通常首选scFv，用Fab的话还要再转成scFV，也没问题，但是Fab筛选到的更接近于天然抗体的结构，只是Fab是单价的，不是双价的。因此，需要根据不同的目的选择。
28.请问PBMC是来自免疫过的个体吗？
A:我们用的PBMC来自于非免疫个体。
29.周老师，目前还是将连接产物用乙醇沉淀来做能达到最高的转化效率吗？
A:我们用PCR-Cleanup试剂盒，不用乙醇沉淀。没有比较过那种方法更好。
30.贵公司转化连接产物到宿主菌时，是用的电转化的方法吗？
A：是的。
31.采用哪一种辅助噬菌体效率更好？
A:没有比较过不同的辅助噬菌体，我们用的是M13KO7。
32.TG1菌株来说连接产物好像达到9次方很难，怎么增加超螺旋结构的连接产物呢？目前还是将连接产物用乙醇沉淀来做能达到最高的转化效率吗？
A:如果连接产物比较少，用乙醇沉淀损失很大，我们用的是PCRclean-up试剂盒，洗脱的时候用水洗脱，不用洗脱液，每ug纯化的连接产物的连接转化效率可以达到1x，最高我们做到2.5x。
33.老师，连接产物的纯化，贵公司是用什么试剂盒来除盐呢？
A：用PCRclean-up试剂盒
34.取外周血时一个donor需要多少血，需要多少donor？
A:每个donor需要多少血，需要多少donor，取决于要建多大多样性的库。
35.周老师，您提到的每微克DNA统计的电转效率是指一个电转反应用量吗？
A:不是。电转效率与做多少个电转不完全相关，电转效率是通过用的DNA总量和得到的总菌落数计算得到的。
36.后续使用怎么让库的容量尽可能下降少一些？
A：我的理解，库容量与多样性有相关性，但库容量不等于多样性。库容量下降可以通过扩增解决，但没有太好的办法可以减少多样性的下降。建好的噬菌体库，加甘油-80度保存，以后就不要老是开，一旦做好，就马上分装好，每次拿一管出来用，这样可以在一定程度上降低多样性下降的程度和速度。~
37.老师你说的是一次电转电1ug的连接产物吗，不是ng10次电转？
A:这个要去试的，取决于你的连接产物的质量，正式确定你的Protocol之前，你可能需要做相当多的预实验。
38.老师，听说sfi酶切效率不是很高，贵公司是如何降低酶切环节成本的呢？
A：是的，不同公司的sfi，酶切效率不一样，哪个产品适合您的样品，可以先试一下，选择最理想的产品。
39.周老师，您觉得重链、轻链分用两步酶切连接的方式建库效果如何？比如pComb3XSS？
A:个人感觉两步酶切连接比较费时，效果也不容易控制。
40.刚提到的是指先建轻链库，然后再建重链库的方式？
A：不是的，是把重链库和轻链库分别拿到以后，一次性的做多片段连接来建库的。
41.老师，贵公司细胞展示技术轻重链用的是一样的信号肽吗？
A：我们用的是不同的信号肽。
42.老师选用不同保护碱基是不是对酶切效率有影响？
A：我没有做过精细的分析。设计引物时，我们会在酶切位点的上游加10个保护碱基，尽量保证PCR产物的酶切效率。
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